果汁飲料中鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的測定及其來源分析

楊春英，劉學(xué)銘，徐玉娟

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610)

2011年4月，臺灣爆發(fā)了堪稱30年來最嚴(yán)重的食品摻毒事件——增塑劑鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(bis(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP)風(fēng)波，這是繼“三聚氰胺”后又一次重大食品安全危機(jī)，已經(jīng)引起全球公眾的極大關(guān)注。增塑劑，又稱為鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters，PAEs)，是一種有毒的化工用塑料軟化劑[1-3]，其對人體的危害性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于三聚氰胺[4-6]，PAEs通過呼吸、飲食和皮膚接觸進(jìn)入人體[7-8]，長期接觸鄰苯二甲酸酯對外周神經(jīng)系統(tǒng)有損傷作用，可引起多發(fā)性神經(jīng)炎和感覺遲鈍、麻木等癥狀，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有抑制和麻醉作用。常用的PAEs主要有鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丙烯酯(DAP)、DEHP、鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)、鄰苯二甲酸二異癸酯(DIDP)等[9-10]。其中，DEHP是一種使用最廣泛的塑化劑[11]，在塑膠材料中普遍使用[12]。DEHP的作用類似于人工荷爾蒙[13]，會危害男性生殖能力并促使女性性早熟，長期攝入可引起生殖系統(tǒng)異常，甚至有造成畸胎、癌癥的危險(xiǎn)。含有DEHP的“起云劑”已被非法應(yīng)用于部分飲料等產(chǎn)品的生產(chǎn)加工[14]，必須重視對飲料等食品中的DEHP檢測。

本研究建立D E H P 的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(g a s chromatography-mass spectrometry，GC-MS)檢測方法，并利用該方法對市售不同包裝規(guī)格果汁飲料(橙汁、葡萄汁、芒果汁、混合果汁)中DEHP的含量進(jìn)行測定，同時對其進(jìn)行溯源分析，以期為果汁飲料的安全性評價提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橙汁、葡萄汁、芒果汁和混合果汁飲料(玻璃瓶裝、500mL紙盒裝和1000mL紙盒裝) 市售。

DEHP標(biāo)準(zhǔn)品(＞99.5%) 美國Sigma公司；正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、甲醇均為色譜純試劑；所用的水為超純水。

準(zhǔn)確稱取0.1000g DEHP標(biāo)準(zhǔn)品于100mL棕色容量瓶中，用正己烷定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。再根?jù)需要逐級稀釋，配成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N/5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司；Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機(jī) 美國Themo公司；超聲波發(fā)生器 寧波新芝生物科技股份有限公司；N-110S-W型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會社；萬分之一分析天平 德國賽多利斯公司；實(shí)驗(yàn)所用的器皿均為玻璃器皿，清洗干凈后用丙酮浸泡2h烘干待用。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜條件

色譜柱：J&W D B-5 M S U I 毛細(xì)管色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量：1.0μL，不分流進(jìn)樣；載氣：高純氦氣，流速為1.0mL/min；程序升溫：初始溫度60℃，保持1min，以20℃/min的升溫速率升至220℃，保持1min，再以5℃/min的升溫速率升至280℃，保持5min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電子電離源(electron ionization，EI)，電子能量70eV；離子源溫度230℃；傳輸線溫度280℃；質(zhì)量范圍40～500u，全掃描方式；溶劑延遲4min。

1.3.3 樣品處理

考察提取溶劑(包括純?nèi)軇┖突旌先軇?、提取方式及提取時間對樣品中DEHP提取率的影響，最終確定樣品處理方法。

1.3.3.1 果汁試樣

采用兩種處理方法：①按照國標(biāo)[15]：取5.00mL果汁試樣，加入2.00mL正己烷振蕩萃取40min，取上層清液進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析；②國標(biāo)[15]基礎(chǔ)上修改：取50.00mL果汁飲料試樣，加入等體積正己烷振蕩萃取40min，取上層清液25.00mL，用氮?dú)鉂饪s至1.0mL，進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.3.2 紙質(zhì)包裝盒的塑料薄膜

取完整一張塑料薄膜(紙盒內(nèi)側(cè)與果汁接觸部分)裁剪成0.5cm×0.5cm大小碎片[16]，準(zhǔn)確稱取2.0000g試樣于具塞三角瓶中，每次加入15mL四氫呋喃-乙腈(1：1，V/V)的混合液，超聲提取30min，過濾轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶，重復(fù)2次，合并濾液定容，待測。

1.3.3.3 紙質(zhì)包裝盒上的塑料蓋

取5個完整塑料蓋破碎成小于0.25cm×0.25cm顆粒[17]，混合均勻后準(zhǔn)確稱取1.0000g試樣于微波萃取管中，加入15mL正己烷-乙酸乙酯(1：1，V/V)的混合液，在100℃條件下微波提取40min，過濾轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶，殘?jiān)蒙倭炕旌弦合礈?次，合并濾液定容；取上述提取液20.00mL，用氮?dú)鉂饪s至1.0mL，進(jìn)行GC-MS分析。

以上處理均設(shè)空白對照。

1.3.4 定性和定量方法

為保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)使用保留時間、標(biāo)準(zhǔn)品對照和質(zhì)譜檢索三者結(jié)合的定性方法；外標(biāo)法峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限

按照本研究優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，配制7個質(zhì)量濃度水平(1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、30.00、50.00mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行GC-MS分析，以峰面積Y對DEHP標(biāo)樣質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性擬合，平行測定3次，得出線性擬合方程Y = 280986X－385822，DEHP質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.9978；檢測限為0.4mg/L(RSN=3)。

2.2 提取溶劑的選擇

參考國內(nèi)外關(guān)于DEHP提取與測定的報(bào)道[14-18]，保持其他試驗(yàn)條件不變，比較正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈5種不同純?nèi)軇┘盎旌先軇赫和?乙酸乙酯(1：1，V/V)、四氫呋喃-乙腈(1：1，V/V)、乙酸乙酯-乙腈(1：1，V/V)對樣品中DEHP的提取效果。以DEHP回收率為判斷依據(jù)，發(fā)現(xiàn)對于果汁飲料樣品，正己烷、二氯甲烷的萃取率最高(回收率＞90%)，但提取時乳化現(xiàn)象比較嚴(yán)重，加入少量甲醇或者冷凍離心分離可大大改善這種狀況，考慮到二氯甲烷毒性較大，故選用正己烷作為果汁樣品的萃取劑；對于包裝材料，單種溶劑不如使用混合溶劑提取效果好，實(shí)驗(yàn)最終確定四氫呋喃-乙腈(1：1，V/V)的混合體系作為塑料薄膜的提取溶劑，正己烷-乙酸乙酯(1：1，V/V)的混合體系作為塑料蓋的提取溶劑，回收率均可達(dá)到80%以上。

2.3 提取方式和時間的選擇

由于果汁飲料屬于液態(tài)食品，故選用液-液萃取。實(shí)驗(yàn)證明：DEHP提取率隨振蕩萃取時間的延長而增加，振蕩萃取時間為40min時，回收率可達(dá)到最高值(92.5%)。

塑料薄膜為軟質(zhì)材料，使用超聲波有利DEHP的溶出，考察不同時間(10、20、30min和40min)、不同提取次數(shù)(1、2次和3次)對DEHP的提取效果，研究表明提取時間為30min時提取效果較好，且提取2次后DEHP提取量增加趨勢不明顯，故選用超聲波提取時間為30min，提取次數(shù)為2次。

塑料蓋為硬質(zhì)材料，微波和高溫條件下可加速DEHP的提取，考察不同溫度(90、95、100℃和105℃)、不同提取時間(20、30、40min和50min)對DEHP提取效果的影響，證實(shí)在100℃條件下微波萃取40min即可提取完全(回收率達(dá)95.8%)。

2.4 方法的精密度和準(zhǔn)確度

為了檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度和精密度，對選取的樣品進(jìn)行高(10.0mg/L)、中(5.0mg/L)、低(1.0mg/L)3個不同水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個水平分別做7份平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1。

表 1 加標(biāo)回收率及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=7)Table 1 Recovery and reproducibility of the analytical method (n=7)

由表1可知，樣品加標(biāo)回收率平均值達(dá)到87%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.64%～6.95%之間，可見，選用的方法具有較強(qiáng)的可靠性，能滿足分析需要。

2.5 實(shí)際樣品的測定及其來源分析

用本研究建立的最優(yōu)化方法，對市售不同廠家生產(chǎn)的不同包裝規(guī)格橙汁飲料樣品中的DEHP進(jìn)行分析，為追溯其來源，同時對其包裝材料進(jìn)行DEHP的測定，結(jié)果見圖1，表2、3。

圖 1 果汁樣品(a)及其加標(biāo)樣(b)總離子流色譜圖Fig.1 TIC of juice sample spiked or not with DEHP standard

由圖1可見，本實(shí)驗(yàn)建立的方法能夠?qū)崿F(xiàn)樣品中的DEHP與基體中其他組分的良好基線分離，樣品的回收率較高。

表 2 果汁樣品中DEHP含量的測定結(jié)果(n=3)Table 2 DEHP content in juice samples (n=3)μg/L

表 3 包裝材料中DEHP含量的測定結(jié)果(n=3)Table 3 DEHP content in plastic packaging materials for juice (n=3)mg/kg

由表2、3可知，由于果汁樣品中DEHP的含量較低，必須經(jīng)過濃縮；除橙汁外，其余3種玻璃瓶裝果汁飲料中始終未檢測到DEHP，表明該果汁在加工過程中未使用DEHP或含有DEHP的“起云劑”，且原料并未受到污染；橙汁飲料經(jīng)濃縮后檢測到微量DEHP，分析其原因可能是加工過程中人為添加或者受污染，也可能是原材料受污染，其來源可能是橙子產(chǎn)地的土壤、大氣及灌溉水源。紙盒裝果汁飲料中檢測到微量的DEHP，塑料包裝材料中均檢測到一定量DEHP，以塑料薄膜含量居高。由于果汁飲料在儲存過程中長期與塑料薄膜直接接觸，且接觸面積較大，而瓶裝飲料存放過程中基本瓶蓋朝上放置，塑料蓋與果汁的接觸面積較小，接觸概率也相對小，故初步認(rèn)為果汁飲料中的DEHP主要是儲藏過程中從包裝材料中遷移污染的，其中塑料薄膜為主要污染因素；紙盒裝橙汁飲料中DEHP含量是玻璃瓶裝的3倍以上，也證實(shí)了包裝材料中DEHP遷移污染，導(dǎo)致橙汁飲料中DEHP含量大大增加。DEHP等PAEs在塑料成型過程中是以氫鍵和范德華力與塑料連接，保留其獨(dú)立的化學(xué)性質(zhì)，隨著使用時間的推移，可不斷地釋放至周圍環(huán)境[19]。釋放的DEHP可溶解在果汁飲料中，造成污染，影響產(chǎn)品質(zhì)量。但從包裝材料中遷移的DEHP含量極低，由于含量過低，經(jīng)濃縮后才檢出，不會對人體造成危害。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)針對果汁飲料及其包裝材料中的DEHP提取技術(shù)和測定方法進(jìn)行了研究，確定了最佳的分析測定條件，方法操作簡單、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高，能較好實(shí)現(xiàn)對實(shí)際樣品的測定。通過對包裝材料中DEHP含量的測定，對果汁飲料的塑化劑來源進(jìn)行分析，為食品安全性和溯源評價提供了一定的參考價值。值得注意的是，企業(yè)在生產(chǎn)過程中應(yīng)該考慮周全、注意各個生產(chǎn)環(huán)節(jié)，避免與DEHP等有害物質(zhì)的接觸污染，保障消費(fèi)者的身體健康。

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