氣相色譜法測定水產(chǎn)品中硫丹及其代謝物殘留

葉 玫，姜琳琳，余 穎

(福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361012)

硫丹(endosulfan)的化學(xué)名為1,2,3,4,7,7-六氯雙環(huán)[2,2,1]庚烯-(2)-雙羥甲基-5,6-亞硫酸酯，分子式：C9H6Cl6O3S，是一種高效有機氯廣譜殺蟲劑，已在我國等多個國家注冊登記并在農(nóng)、林業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用[1]。硫丹對幾乎所有種類的動物均具有毒性，在環(huán)境中有很強的持久性，生物蓄積性潛力較大，有遠(yuǎn)距離環(huán)境遷移能力，同時是一種環(huán)境雌激素，干擾動物及人類的激素分泌和代謝，因此被列為持久性有機污染物[2-6]，將在全球范圍內(nèi)禁止生產(chǎn)和使用[7]。商品硫丹是2個空間異構(gòu)體α-硫丹、β-硫丹2：1～7：3的混合物；其主要代謝物硫丹硫酸酯具有和硫丹相當(dāng)?shù)亩拘裕诃h(huán)境中的半衰期更長，因此在藥殘監(jiān)控檢測中“硫丹”通常是指硫丹母體和其代謝物硫丹硫酸酯的混合殘留物[1-2]。

硫丹可通過水環(huán)境或漁用配合飼料中的植物性原料等途徑，污染養(yǎng)殖水產(chǎn)品，影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全[8]。自日本2006年5月實施《肯定列表》制度以來，檢出多例從中國進口的鰻鱺和泥鰍的硫丹殘留超標(biāo)，受此影響，輸日活鰻曾一度暫停[9]。輸日水產(chǎn)品硫丹超標(biāo)事件之后，國內(nèi)研究者相繼開展對水產(chǎn)品硫丹殘留的檢測方法研究[10-20]，氣相色譜-電子捕獲檢測器(gas chromatographyelectron capture detection，GC-ECD)[10-15]和氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrography，GC-MS)[16-19]是較為有效的檢測方法。GC-ECD具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確、儀器配置要求較低、適合于未配備GC-MS的基層實驗室開展日常檢測等優(yōu)點，但其定性受基質(zhì)干擾影較大，對樣品的凈化程度要求較高?，F(xiàn)有水產(chǎn)品中硫丹的GC-ECD檢測方法在實際應(yīng)用中，仍存在缺陷和不完善之處，如：樣品前處理繁瑣成本較高[12]，方法的建立僅局限于特定水產(chǎn)品[10-13]，檢測目標(biāo)物未包含代謝物[10-11,14-15]，回收率偏低[14]等。本實驗在綜合分析近年報道的相關(guān)檢測方法的基礎(chǔ)上，研究以GC-ECD法，建立快捷實用、準(zhǔn)確可靠、靈敏度達(dá)到國內(nèi)外現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)限量要求、適合于魚類、甲殼類和貝類等水產(chǎn)品中硫丹及其代謝物硫丹硫酸酯殘留量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

α-硫丹(α-endosulfan，CAS編碼：959-98-8)、β-硫丹(β-endosulfan，CAS編碼：33213-65-9)標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度均為100μg/mL，不確定度均小于±0.16μg/mL) 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；硫丹硫酸酯(endosulfan sulfate，CAS編碼：1031-07-8，純度98%，臨用前用乙酸乙酯逐級稀釋至適當(dāng)濃度) 德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、乙酸乙酯為色譜純；無水硫酸鈉為分析純(500℃灼燒4h)；SEPAX固相萃取小柱：中性氧化鋁小柱(2000mg/6mL)、石墨化碳黑-佛羅里硅土復(fù)合小柱(250mg/1000mg/6mL)。

6890N氣相色譜儀(配有63Ni微電子捕獲檢測器(μ-ECD))、DB-1MS毛細(xì)管柱(30.0m×250μm，0.25μm) 美國Agilent公司；AB204-E 電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；R205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；MS3 旋渦混合器 德國IKA公司；KQ-250DE 數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；LD4-8離心機 北京時代北利醫(yī)用離心機有限公司；Alltech固相萃取裝置 美國奧泰公司。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1 提取

取貝類的軟組織、魚和蝦的肌肉，用均質(zhì)機破碎混勻，置冰箱中2～6℃冷藏待測或－18℃冷凍暫存。稱均質(zhì)樣品3g(準(zhǔn)確至0.01g)于50mL具塞離心管，加無水硫酸鈉6g，分散均勻，加乙腈-乙酸乙酯(1：4，V/V)混合液15mL，浸泡試樣30min，超聲10min，渦旋混合2min，2000r/min離心5min，上層有機相過無水硫酸鈉(約10g)收集于雞心瓶；用乙腈-乙酸乙酯混合液15mL，重復(fù)萃取試樣一次，合并萃取液，于35℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。

1.2.2 凈化

雞心瓶內(nèi)加3mL乙腈，渦旋混合10～20s，－18℃冷凍30min以上。準(zhǔn)備石墨化碳黑-佛羅里硅土復(fù)合小柱、中性氧化鋁小柱各一支，依次串聯(lián)固定于固相萃取裝置上，在石墨化碳黑-佛羅里硅土復(fù)合小柱上裝填無水硫酸鈉約1cm高，用6mL乙腈活化小柱；取出冷凍雞心瓶，立即將上層乙腈轉(zhuǎn)入萃取小柱，控制流速1滴/s，開始收集流出液；用3mL冰冷的乙腈洗滌雞心瓶，洗滌液并入小柱；再用10mL乙腈-乙酸乙酯(1：4，V/V)洗脫液淋洗層析柱；流出液轉(zhuǎn)入25mL梨形瓶中，于35℃旋轉(zhuǎn)減壓濃縮至干，殘渣用1mL乙酸乙酯溶解定容，供氣相色譜分析。

1.3 氣相色譜分析條件

色譜柱：DB-1MS(30m×250μm，0.25μm)；檢測器：ECD；載氣：99.999%高純氮氣；載氣流速：1.0mL/min；進樣口溫度：260℃；檢測器的溫度：300℃。色譜柱升溫程序：初始溫度100℃，保持1min，以30℃/min升至150℃，再以5℃/min升至185℃，然后以10℃/min升至280℃，保持5min。進樣方式：不分流進樣，進樣量：1μL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

以乙酸乙酯為溶劑，配制硫丹系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯質(zhì)量濃度均分別為0.001、0.004、0.01、0.02、0.04、0.1、0.2μg/mL，進行氣相色譜測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算線性相關(guān)系數(shù)。

1.5 方法驗證

方法主要實驗條件的確定后，分別以有代表性的水產(chǎn)品：南美白對蝦(甲殼類)、草魚(低脂魚)、鰻鱺(高脂魚)、僧帽牡蠣(貝類)空白樣品為測試對象，進行加標(biāo)回收實驗，樣品中α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的添加量分別為1、10μg/kg和20μg/kg，計算每個水平6次重復(fù)實驗的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以驗證方法的適用性，評價方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度，確定方法的最低定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜分析條件優(yōu)化

已報道的硫丹GC-ECD分析方法，色譜分離柱采用DB-5[10-11,13-15]和HP-1701[12]，兩者分別屬于弱極性和中等極性柱，對硫丹及其代謝物均有較好的分離效果。滴滴涕是水產(chǎn)品基質(zhì)常見的藥殘，同為有機氯農(nóng)藥，在樣品前處理過程中和硫丹是共萃物，在氣相色譜分析中，和硫丹出峰時間相近。實驗分析了滴滴涕同系物和硫丹在DB-5、HP-1701中色譜分離行為，DB-5中，滴滴涕同系物o,p’-DDD和β-硫丹非?？拷茈y達(dá)到基線分離；HP-1701中，另一同系物p,p’-DDT和β-硫丹幾乎重疊。但采用DB-1色譜柱，通過優(yōu)化色譜升溫程序，滴滴涕同系物和硫丹各組分均能完全達(dá)到基線分離，不形成對硫丹定性定量干擾。

色譜柱升溫程序?qū)x器的靈敏度有較大的影響。硫丹氣相色譜分析柱升溫程序的起始溫度大致有80℃[18]和160℃[15]兩種模式，實驗中發(fā)現(xiàn)，在升溫速率(20℃/min)、載氣流速(1.0mL/min)等其他色譜條件相同的情況下，以80℃為起始溫度的升溫模式，出峰時間較以160℃為起始溫度的升溫模式慢5min左右，但硫丹各組分峰高響應(yīng)較后者高近4倍。權(quán)重考慮分析靈敏度及避開滴滴涕同系物干擾因素，兼顧節(jié)省分析時間，本方法采用100℃初始溫度，升溫程序為初始溫度100℃，保持1min，以30℃/min升至150℃，再以5℃/min升至185℃，然后以10℃/min升至280℃，保持5min。圖1為優(yōu)化后的色譜條件的硫丹標(biāo)準(zhǔn)溶液(3ng/mL)氣相色譜圖，硫丹出峰時基線穩(wěn)定，峰形尖銳對稱，儀器的靈敏度高，一個樣品的上機分析時間約20min。

圖 1 硫丹及代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(3ng/mL)Fig.1 GC chromatogram of standard solutions of endosulfan and its metabolite (3 ng/mL)

2.2 萃取劑的選擇

萃取劑的選擇原則是將樣品中的目標(biāo)物充分提取出來，對脂肪等雜質(zhì)溶出又要盡可能小，降低后續(xù)樣品凈化的難度。由于硫丹易溶于多數(shù)有機溶劑，不溶于水，所以樣品中硫丹的提取大都采用有機混合液萃取的方法，如：乙腈-乙酸乙酯(4：1，V/V)[11,15]、丙酮-正已烷(4：3.5，V/V)[12]、正已烷-丙酮(1：1，V/V)[13]、乙酸乙酯[10]、乙腈[14]等，選用乙酸乙酯、丙酮、正已烷可以獲得很高的萃取率，但這些溶劑對脂肪的溶解度也較大，油脂含量高的樣品如鰻鱺等，用GC-ECD檢測，樣品的本底干擾大，對目標(biāo)物難于定性定量。乙腈對有機氯農(nóng)藥有較好的溶解度，但對大部分油脂的溶解性較差，在乙腈中加入適量的乙酸乙酯，可提高對目標(biāo)物的萃取效果。通過實驗比對，本方法選擇乙腈-乙酸乙酯(4：1，V/V)為萃取劑。

2.3 凈化方法研究

水產(chǎn)品種類多，基質(zhì)復(fù)雜，高脂魚如鰻鱺，脂肪含量約為30%，凈化過程中，如何降低和除去脂肪是非常關(guān)鍵的步驟。凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography，GPC)對鰻鱺樣品的凈化效果良好[12]，但設(shè)備價格昂貴，溶劑的消耗量較大，過程繁瑣費時。在參考前人研究的基礎(chǔ)上[11,15]，通過大量的實驗摸索，本方法采用冷凍除脂、固相萃取(solid-phase extraction，SPE)的凈化方案。

樣品經(jīng)乙腈-乙酸乙酯混合溶液萃取蒸干后，加入乙腈溶解，待測目標(biāo)物溶于乙腈中，而大部分油脂都沉淀在底部和壁上，再通過冷凍以降低油脂在乙腈中的溶解度來達(dá)到去脂的效果。此方法可有效減少脂溶性雜質(zhì)的干擾，但還不能達(dá)到上機檢測的要求，所以采用固相萃取法，進一步去除油脂和其他干擾物質(zhì)。實驗選擇油脂含量較高的鰻鱺為基質(zhì)，以乙腈-乙酸乙酯(4：1，V/V)為洗脫液，對幾種不同規(guī)格的SPE小柱的凈化效果進行和比較：分別用1000mg/6mL佛羅里硅土、1000mg/6mL中性氧化鋁、2000mg/6mL中性氧化鋁小柱凈化，凈化效果均不夠理想，α-硫丹的回收率偏高，而雜質(zhì)峰對硫丹硫酸的定量影響更大，因此考慮將兩種小柱串聯(lián)使用。部分水產(chǎn)品，如甲殼類、某些貝類體含有色素，商品化的復(fù)合小柱如石墨化碳黑-佛羅里硅土復(fù)合柱(250mg/1000mg/6mL)使用起來非常方便，和2000mg/6mL中性氧化鋁小柱串聯(lián)，上層的石墨化碳黑-佛羅里硅土復(fù)合小柱上裝填無水硫酸鈉約1cm高，以去除樣液中可能殘余的少量水分。用這樣串聯(lián)小柱對樣品進行凈化，基質(zhì)干擾基本消除，色素被完全吸附，達(dá)理想的凈化效果。

為了使硫丹各組分從SPE柱完全洗脫下來，對洗脫劑用量進行優(yōu)化實驗。3g鰻鱺樣品，按上述方法提取、冷凍除脂，添加硫丹各單體為60ng的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣液過串聯(lián)小柱，用乙腈-乙酸乙酯(4：1，V/V)淋洗，間隔2.5mL收集流出，洗脫曲線如圖2所示，在洗脫體積為12.5mL時，各組分回收率達(dá)到85%以上，15mL時已檢不出目標(biāo)物，因此最佳洗脫體積為15mL。

圖 2 硫丹的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of endosulfan

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

硫丹在南美白對蝦、草魚、僧帽牡蠣、鰻鱺空白樣品中的加標(biāo)回收實驗結(jié)果如表1所示，α-硫丹的平均回收率74.1%～95.8%、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.69%～7.33%；β-硫丹的平均回收率為74.9%～95.3%、RSD為1.22%～7.79%；硫丹硫酸酯平均回收率為86.3%～108%、RSD為2.38%～7.20%。結(jié)果表明，本方法的準(zhǔn)確度、精密度符合藥殘檢測技術(shù)要求，適用于魚類、甲殼類和貝類水產(chǎn)品。

表 1 方法的平均回收率和精密度(n=6)Table 1 Recovery and precision of the method (n=6)

2.5 方法的線性范圍、檢出限和最低定量限

表 2 硫丹測定的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限Table 2 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection, limits of quantification for α-endosulfan, β-endosulfan and endosulfan sulfate

圖 3 空白對蝦樣品色譜圖Fig.3 GC chromatogram of blank shrimp sample

圖 4 最低定量限水平(1μg/kg)的空白對蝦樣品加標(biāo)色譜圖Fig.4 GC chromatogram of blank shrimp sample spiked with endosulfan at the limit of quantification of 1 μg/kg

方法的線性范圍、檢出限和最低定量限如表2所示。硫丹各組分在0.001～0.2μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)不小于0.9996。方法檢出限以空白樣品信噪比不小于3估算，α-硫丹的檢出限為0.035μg/kg，β-硫丹和硫丹硫酸酯的檢出限均為0.06μg/kg。方法最低定量限的確定依據(jù)是樣品的實際加標(biāo)回收率在70%～120%之間，信噪比不小于10，精密度不大于15%；從表1可知，硫丹各組分加標(biāo)量為1μg/kg時，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的信噪比大于10，實際回收率78.2%～108%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.22%～7.79%，因此，本方法確定α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的最低定量限均為1.00μg/kg，低于日本肯定列表中水產(chǎn)品硫丹總量0.004mg/kg的限量要求[21]。空白對蝦樣品色譜圖和最低定量限水平的空白對蝦樣品加標(biāo)色譜圖如圖3、4所示。

3 結(jié) 論

本實驗建立水產(chǎn)品中硫丹及其代謝物硫丹硫酸酯殘留的GC-ECD檢測方法。選擇DB-1色譜分析柱，消除基質(zhì)中可能存在的滴滴涕污染物對目標(biāo)物定性定量的干擾；優(yōu)化色譜升溫程序，提高儀器對硫丹各組分的響應(yīng)靈敏度；采用冷凍、佛羅里硅土-中性氧化鋁固相萃取凈化樣品，有效地去除樣品中的脂類等雜質(zhì)。建立的分析方法穩(wěn)定靈敏，可操作性強，適用于魚類、甲殼類、貝類水產(chǎn)品，儀器配置、運行成本較低，適合基層實驗室開展對水產(chǎn)品硫丹殘留的日常檢測。

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