超強(qiáng)磁性微球提取深加工轉(zhuǎn)基因食品DNA

王愛(ài)迪，冉曉華，陳 磊,*，趙衛(wèi)東

(1.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；2.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物和食品檢測(cè)中心，天津 300461)

自1994年首例轉(zhuǎn)基因植物——轉(zhuǎn)基因耐儲(chǔ)藏番茄在美國(guó)批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)以來(lái)，轉(zhuǎn)基因植物的研發(fā)、生產(chǎn)和試驗(yàn)規(guī)模均快速增長(zhǎng)。轉(zhuǎn)基因植物主要有大豆、馬鈴薯、番茄等，并被廣泛加工成食品流入市場(chǎng)[1-3]?；趯?duì)轉(zhuǎn)基因食品的安全及生物環(huán)境安全的考慮，各國(guó)政府相繼建立法規(guī)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的研究、生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯存、銷(xiāo)售和進(jìn)出口等所有環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控[4-6]。目前食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法應(yīng)用較廣泛的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real time-polymerase chain reaction，qRTPCR)，即通過(guò)對(duì)樣品基因組核酸中的外源基因的擴(kuò)增和定量來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的定性和定量檢測(cè)[7-9]。使用PCR法檢測(cè)深加工食品中的轉(zhuǎn)基因成分，面臨的最大挑戰(zhàn)是如何有效地提取到DNA模板，其難度不僅在于食品加工過(guò)程中DNA會(huì)遭到嚴(yán)重破壞，而且受物理、化學(xué)和生物等因素的影響使DNA質(zhì)量降低[10]。

由于深加工產(chǎn)品的DNA提取技術(shù)是轉(zhuǎn)基因成分定性和定量檢測(cè)的瓶頸，因此，很多實(shí)驗(yàn)室都在研究深加工產(chǎn)品的DNA提取方法?，F(xiàn)有的DNA提取技術(shù)大多依賴(lài)各種試劑盒，花費(fèi)較高；一些研究通過(guò)其他手段提取DNA，但提取過(guò)程繁雜，較為耗時(shí)[11-12]。

盡管已有多種DNA提取方法可供選擇，深加工食品如馬鈴薯淀粉和食用大豆油中DNA降解嚴(yán)重，含量低，樣品基質(zhì)黏稠，因此此類(lèi)樣品中的DNA提取仍然是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的課題。本實(shí)驗(yàn)以磁響應(yīng)性高、表面包覆二氧化硅的磁性四氧化三鐵微球?yàn)楣滔辔絼?，從植物源食品中提取基因組DNA模板，然后選擇適當(dāng)序列的引物，對(duì)DNA模板中的內(nèi)源和外源基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。內(nèi)源基因的擴(kuò)增用以驗(yàn)證純化DNA的可擴(kuò)增性；外源基因的擴(kuò)增用于轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。通過(guò)與傳統(tǒng)方法的DNA提取量、純度、PCR擴(kuò)增效果、qRT-PCR數(shù)據(jù)結(jié)果、提取時(shí)間、費(fèi)用等幾個(gè)方面比較，對(duì)磁性微球提取基因組核酸方法與qRT-PCR相結(jié)合的檢測(cè)方法用于深加工食品中轉(zhuǎn)基因檢測(cè)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆(抗草甘膦基因)、馬鈴薯(抗Bt基因)陽(yáng)性對(duì)照品 天津市出入境檢疫局動(dòng)植食檢測(cè)中心；其他食品 市購(gòu)。

十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇8000 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；蛋白酶K 德國(guó)Merck公司；鹽酸胍 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；10×PCR Buffer、10×Ex Taq Buffer、dNTP Mix(2.5mmol/L)、rTaq(5U/μL)、Ex Taq HS (5U/μL)、各種引物等生物試劑均由TaKaRa公司合成(表1)；Affimag FEO磁性四氧化三鐵微球(200nm，飽和磁化率78emu/g) 天津市倍思樂(lè)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)中心；Omega?磁珠核酸提取試劑盒、Omega?硅膠柱核酸提取試劑盒、Wizard?磁珠核酸提取試劑盒 美科美(北京)生物醫(yī)學(xué)有限公司。

UV2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；PCR儀 德國(guó)Biometra公司；Light Cycler 480實(shí)時(shí)定量PCR儀 德國(guó)Roche公司；DYCP-31C水平電泳槽 美國(guó)Bio-Rad公司；BioDoc-IT220凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司。

表 1 引物序列及其大小Table 1 Sequences and fragment sizes of primers

1.2 方法

1.2.1 核酸的提取

Affimag磁珠法：將大豆(種子研磨)、豆腐、腐乳、大豆油、馬鈴薯(鮮品)、薯?xiàng)l、薯泥和淀粉(馬鈴薯)等固體樣品用液氮研磨。各稱(chēng)取0.5g于離心管中，加入預(yù)熱的細(xì)胞裂解液(0.01mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，0.002mol/L乙二胺四乙酸二鈉，2g/100mL十二烷基硫酸鈉(SDS)，pH8.0)5mL，5mol/L的鹽酸胍溶液0.5mL，10mg/mL的蛋白酶K溶液0.05mL。55℃溫育30min，加入10μL 3mg/mL的RNase，反應(yīng)5min，12000r/min離心5min得到樣品液。取0.5mL 10mg/mL的磁性微球懸液放于1.5mL的離心管中，磁分離棄去清液，加入吸附液(聚乙二醇8000 20g/mL，2mol/L NaCl)1.0mL，振搖混勻，加入樣品液0.5mL，室溫充分混勻10min。磁場(chǎng)分離，棄去清液。再加入吸附液1.0mL，同法處理一遍。70%乙醇洗滌磁珠兩遍，棄去洗滌液，室溫下風(fēng)干。加入TE(0.01mol/L EDTA，0.025mol/L Tris-HCl，pH8.0)緩沖液0.5mL，輕輕顛倒10min，使磁珠充分分散均勻。磁分離，清液即為DNA提取液，備用。豆油體積為200mL，淀粉質(zhì)量為10g，提取步驟同前。

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法，操作步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[15]；Omega?硅膠試劑盒、Omega?磁珠試劑盒、Wizard?磁珠試劑盒的使用參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

每種方法針對(duì)每種樣品做3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 DNA樣品的檢測(cè)

1.2.2.1 DNA質(zhì)量濃度和純度的測(cè)定

用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA在260nm波長(zhǎng)處的吸光度(A260)，計(jì)算所提DNA的質(zhì)量濃度，DNA的質(zhì)量濃度/(μg/mL)=A260×50。檢測(cè)基因組DNA在260nm和280nm 波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)A260/A280值判斷DNA 純度。

1.2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

將提取的DNA進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，制備1%的瓊脂糖凝膠，上樣配比為5μL 核酸樣品溶液＋1μL 6×Loading Buffer＋1μL 100×SYBR Green。取上述混合配比溶液5μL。電泳條件為80V，40min。

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

表 2 PCR以及qRT-PCR反應(yīng)體系Table 2 Reaction system of PCR and qRT-PCR

普通PCR反應(yīng)體系(表2)的反應(yīng)條件為95℃、1min，95℃、10s，60℃、40s，72℃、40s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。選擇25μL反應(yīng)體系。制備3%的瓊脂糖凝膠，上樣配比同1.2.2.2節(jié)，電泳條件為80V，40min。

qRT-PCR的反應(yīng)體系(表2)的反應(yīng)條件為95℃、30s，95℃、15s，60℃、40s，45個(gè)循環(huán)；40℃、30s。選擇25μL反應(yīng)體系，每個(gè)模板DNA做2個(gè)平行，Ct值取平均值。

1.2.3 實(shí)際樣品的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)

選擇幾種常見(jiàn)的市售食品，用Affimag磁珠法提取樣品DNA(每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù))，并對(duì)其進(jìn)行內(nèi)源基因以及外源基因啟動(dòng)子CaMV35S和終止子NOS檢測(cè)，提取步驟以及qRT-PCR反應(yīng)體系參照1.2.2節(jié)和1.2.3節(jié)。每個(gè)DNA模板做2個(gè)平行。其中Ct值表示反應(yīng)管的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，該值越小，表明反應(yīng)管內(nèi)DNA含量越高。Ct＜36表示該目的基因?yàn)殛?yáng)性；Ct＞40表示目的基因?yàn)殛幮裕?6＜Ct＜40，需要做重復(fù)實(shí)驗(yàn)判斷陽(yáng)性陰性結(jié)果[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種方法提取基因組DNA的檢測(cè)

圖 1 樣品基因組DNA電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the DNA from samples

圖 2 5種DNA提取方法提取的樣品DNA的純度(A260/A280)(A)和含量(B)Fig.2 Purity (A260/A280) (A) and quantity (B) of extracted DNA samples determined by five different methods

采用CTAB法、Omega?硅膠柱法、Wizard?磁珠法、Omega?磁珠法和Affimag磁珠法5種不同方法提取DNA樣品，結(jié)果見(jiàn)圖1。未經(jīng)過(guò)加工的大豆和馬鈴薯鮮品，采用不同的提取方法都可以得到整齊明亮的DNA條帶，為基因組DNA，分子質(zhì)量大于10kbp；經(jīng)過(guò)加工后的豆腐，薯?xiàng)l，薯泥，只能觀察到一些彌散拖尾的小片段DNA，分子質(zhì)量基本小于1kbp；而深加工的大豆油，腐乳和馬鈴薯淀粉樣品中的DNA含量很低，用不同方法提取的樣品在瓊脂糖凝膠電泳上均未看到明顯的DNA條帶，將通過(guò)后續(xù)PCR以及qRT-PCR來(lái)檢測(cè)DNA的提取效率。為了定量檢測(cè)所提取的DNA的含量和純度，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品在260nm和280nm波長(zhǎng)處的紫外吸光度，根據(jù)1.2.2.1節(jié)中的公式計(jì)算其質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖2所示。由于豆油的DNA質(zhì)量濃度很低，在圖2B中不能顯示，其結(jié)果是CTAB法為0.002μg/g，Omega? 硅膠柱法為0.017μg/g，Wizard?磁珠法為0.012μg/g，Omega? 磁珠法為0.024μg/g，Affimag 磁珠法為0.032μg/g。由圖2可知，采用Affimag磁珠提取方法所提取的DNA含量大部分樣品較高，A260/A280比值為1.10～1.80，表明此方法在DNA提取過(guò)程中細(xì)胞裂解液裂解程度較完全，去除雜質(zhì)(糖類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi))能力較強(qiáng)；同時(shí)在提取過(guò)程中避免了高速離心，只需要吸附、洗滌、洗脫步驟即可得到DNA樣品，提取過(guò)程中對(duì)DNA機(jī)械力損傷較小。

2.2 5種方法提取DNA的PCR和qRT-PCR檢測(cè)

以5種方法提取的各種食品的基因組DNA為模板，對(duì)大豆樣品和馬鈴薯樣品分別進(jìn)行大豆內(nèi)源基因Lectin和馬鈴薯內(nèi)源基因UGP的PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖 3 不同方法提取的樣品內(nèi)源基因PCR電泳檢測(cè)Fig.3 Agarose gel electrophoresis patterns of PCR products

對(duì)于CTAB法來(lái)說(shuō)，大豆類(lèi)食品中只有大豆和豆腐擴(kuò)增到目的條帶，而腐乳和大豆油由于樣品加工程度深，并且加入了一些添加劑，所提取的核酸樣品未能得到目的條帶，電泳中條帶為引物二聚體擴(kuò)增條帶；馬鈴薯樣品中，只有馬鈴薯淀粉由于加工程度較深未能擴(kuò)增到目的條帶。而幾種試劑盒方法，腐乳只有Omega?硅膠柱法可以擴(kuò)增到目的基因，大豆油和馬鈴薯淀粉未能擴(kuò)增到目的條帶，一方面可能是由于樣品本身原因?qū)е绿崛『怂針悠焚|(zhì)量少低于PCR或凝膠電泳的檢測(cè)限，另一方面可能是所提取的核酸樣品中核酸聚合酶抑制劑的存在導(dǎo)致不能有效擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)采用的Affimag磁珠方法，大豆和馬鈴薯所有樣品都能擴(kuò)增得到目的條帶，尤其大豆油和馬鈴薯淀粉均可以擴(kuò)增出特異的目的條帶(圖3)，并且在含量、質(zhì)量和純度等方面滿(mǎn)足了PCR和目的擴(kuò)增基因的電泳檢測(cè)靈敏度的要求，擴(kuò)增的目的條帶清晰。表明該方法更加適用于從深加工食品中提取核酸樣品。

同時(shí)，為了驗(yàn)證PCR擴(kuò)增結(jié)果的可靠性，同時(shí)進(jìn)行了大豆和馬鈴薯內(nèi)源基因的qRT-PCR擴(kuò)增，由于qRT-PCR在反應(yīng)中加入了熒光標(biāo)記引物，除了可以進(jìn)行定量研究之外，還提高了核酸擴(kuò)增反應(yīng)的準(zhǔn)確性以及檢測(cè)的靈敏度[16]，因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證核酸的可擴(kuò)增性，以5種方法提取的各種食品的基因組DNA為模板，對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，從所得的擴(kuò)增曲線(xiàn)以及Ct值(表3)可得到從待檢樣品中檢測(cè)到各樣品對(duì)應(yīng)內(nèi)源基因的含量，Ct值結(jié)果與普通PCR擴(kuò)增到的目的條帶亮度(圖3)基本一致。同時(shí)，qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了本方法在相同樣品量的條件下所提取的大豆油和馬鈴薯淀粉的DNA含量最高(Ct值分別為34.10和28.64)，表明本方法所提取的DNA可以用于qRT-PCR檢測(cè)。

表 3 各種樣品DNA qRT-PCR的Ct值Table 3 qRT-PCR Ct of the DNA samples

2.3 市售產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)

為了檢測(cè)幾種市售食品是否含有轉(zhuǎn)基因成分，采用本方法提取所購(gòu)買(mǎi)的樣品核酸，并且通過(guò)qRT-PCR擴(kuò)增內(nèi)源基因(大豆類(lèi)食品擴(kuò)增Lectin基因片段，馬鈴薯類(lèi)擴(kuò)增UGP基因片段)以及外源基因CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的Ct值(表4)對(duì)各種轉(zhuǎn)基因食品中的轉(zhuǎn)基因含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，各食品內(nèi)源基因擴(kuò)增的Ct值均小于36，表明所提取的DNA樣品為各自對(duì)應(yīng)的基因組DNA，大豆、馬鈴薯Ct值較小，表明所提取的DNA相對(duì)含量較高；其他幾種食品由于受加工過(guò)程的影響，以及食品本身的特性，Ct值較大，DNA含量較低。根據(jù)CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子的擴(kuò)增Ct值(均大于36)表明，所購(gòu)買(mǎi)食品均為非轉(zhuǎn)基因食品。qRT-PCR用時(shí)短，僅需70min，不需后續(xù)電泳檢測(cè)，減少了檢測(cè)時(shí)間。將本方法與qRTPCR聯(lián)合應(yīng)用，可以縮短轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)時(shí)間，減少檢測(cè)結(jié)果假陰性的可能性，提高轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

表 4 樣品各基因組qRT的Ct值Table 4 qRT Ct of the DNA samples

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以超高磁性的四氧化三鐵磁珠為分離基質(zhì)，提取深加工食品的基因組或片段DNA的量較高，純度較高，能夠滿(mǎn)足PCR以及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的要求，均達(dá)到或超過(guò)試劑盒的提取效果，同時(shí)，僅有Affimag方法可以從淀粉、豆油等深加工食品中提取得到基因組DNA碎片，并且通過(guò)PCR電泳檢測(cè)到目的基因，且qRT-PCR的Ct值均小于36，也證明了所提取DNA可以用于目的基因的檢測(cè)，表明該方法可以從深加工食品中提取到核酸片段，該方法的提取效率和靈敏度較高。此過(guò)程無(wú)需使用有機(jī)溶劑，安全性較高，操作較簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，不到1.5h即可完成DNA提取步驟，滿(mǎn)足高通量自動(dòng)核酸提取技術(shù)發(fā)展的要求，可以應(yīng)用于出入境大批量常規(guī)樣品檢驗(yàn)的DNA快速提取，加快檢驗(yàn)速度。

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