正交試驗(yàn)優(yōu)化馬鈴薯龍葵素提取技術(shù)

鐘 源，肖文軍,2,*，馬 蕊，李政澤

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

馬鈴薯為茄科植物，與水稻、小麥、玉米、高粱并稱為世界五大糧食作物。我國(guó)是世界上最大的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)，種植面積占世界的1/4，產(chǎn)量占1/5[1]。研究表明，馬鈴薯中含有一類叫龍葵素的生物堿類活性物質(zhì)，通常被稱為總糖苷生物堿[2]，主要包括茄堿和卡茄堿兩種[3]；具有抑制消化道腫瘤細(xì)胞增殖、抗菌、驅(qū)蟲等生理活性，因而具有很好的開發(fā)利用前景[4]。龍葵素在馬鈴薯中含量為3～10mg/100g[5-6]；當(dāng)馬鈴薯受到病菌感染、機(jī)械等損傷，發(fā)芽、變綠或腐爛時(shí)，龍葵素的含量會(huì)顯著提高[7-8]。段光明等[9]研究了單溶劑法、雙溶劑法、混合溶劑法對(duì)馬鈴薯龍葵素提取效果，提示混合溶劑提取法效果最好，但試劑成本過高。張薇等[10-11]在比較研究乙醇回流提取、雙溶劑提取以及混合溶劑提取3種方法效果的基礎(chǔ)上，對(duì)馬鈴薯龍葵素的微波輔助提取進(jìn)行了工藝優(yōu)化，但微波產(chǎn)生的高溫易破壞龍葵素的結(jié)構(gòu)，且溶劑易揮發(fā)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)馬鈴薯的深加工主要集中于淀粉的提取與利用，而對(duì)其生物堿(龍葵素)、花色苷等生理活性成分則未能得到綜合開發(fā)利用，不能滿足馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求。為此，本研究在利用正交試驗(yàn)優(yōu)化雙溶劑提取法和超聲波輔助提取法提取馬鈴薯龍葵素的基礎(chǔ)上，綜合比較乙醇回流提取、微波輔助提取、雙溶劑提取、超聲波輔助提取4種方法對(duì)馬鈴薯龍葵素提取的效果；以期為馬鈴薯龍葵素的高效、綠色工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，推動(dòng)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的綜合、高值化發(fā)展，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮馬鈴薯，于室溫遮光條件下放置10d左右，待馬鈴薯皮變綠，發(fā)出新芽，取其5mm左右厚的皮，放置60℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，粉碎過篩備用。

龍葵素標(biāo)準(zhǔn)樣品：α-茄堿(純度≥95%) 美國(guó)Sigma 公司。

SK3300H 超聲波清洗儀 上?？茖?dǎo)超聲波儀器有限公司；MM721AAU-PW美的微波爐 廣東美的微波爐制造有限公司；UV-2600 型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 龍葵素檢測(cè)[12]及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取3mg龍葵素標(biāo)準(zhǔn)品，用1%硫酸溶解，定容至3mL，即得質(zhì)量溶度為1g/L的龍葵素溶液。分別取龍葵素溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于5mL容量瓶中，用1%硫酸稀釋到2mL，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L的龍葵素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。取2mL，于冰水浴中緩慢加入5mL濃硫酸，其時(shí)間不少于3min，靜置1min，加入1%甲醛2.5mL，其時(shí)間不少于2min，靜置90min，取一定量進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為534nm，以2mL 1%的硫酸為空白，于534nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，得到回歸方程y＝0.9237x＋0.0132。

式中：c為樣品吸光度對(duì)應(yīng)的龍葵素質(zhì)量濃度/(g/L)；v為提取液的體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.2.2 乙醇回流提取[10]

稱取馬鈴薯皮20g于500mL圓底燒瓶，加入100mL 95%(V/V)乙醇，55～65℃回流提取4h。提取液過濾，50℃旋轉(zhuǎn)濃縮至浸膏狀，1%的硫酸多次溶解定容，紫外比色，計(jì)算得率，以下提取實(shí)驗(yàn)的提取液均按此處理。

1.2.3 微波輔助提取[11]

稱取馬鈴薯皮10g于500mL燒杯，按乙醇：乙酸體積比為100：10，料液比1：20(g/mL)，在540W微波功率下提取6min。抽濾后，將濾液和殘?jiān)盅b入索氏提取器中，在55～65℃抽提16h。

1.2.4 雙溶劑(乙醇-乙酸)提取[13-14]

1.2.4.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

稱取粒徑為0.8mm的馬鈴薯皮20.0g若干份，置于500mL圓底燒瓶中，加入乙醇乙酸體積比為10：3的雙溶劑300mL，浸泡攪拌15min，抽濾，將濾液和樣品分裝入索氏提取器中，80℃條件下提取18h。固定其他條件，分別考察提取時(shí)間(12～20h)、提取溫度(50～80℃)、料液比(1：5～1：20)、pH值(2.7、2.9、3.2、4.5)，對(duì)應(yīng)的乙醇乙酸體積比分別為(10：4～10：1)、原料粒徑(0.2～0.8mm)對(duì)提取效果的影響，探討提取時(shí)間的影響時(shí)固定的提取溫度為65℃，探討原料粒徑的影響時(shí)固定的乙醇乙酸體積比為10：2。

新會(huì)計(jì)制度更加重視《中華人民共和國(guó)會(huì)計(jì)法》、《中華人民共和國(guó)預(yù)算法》的作用，這在一定程度上對(duì)行政事業(yè)單位的財(cái)務(wù)工作者起到了規(guī)范作用。新制度涵蓋了我國(guó)各級(jí)政府會(huì)計(jì)主體，對(duì)于我國(guó)行政事業(yè)單位會(huì)計(jì)信息的完整和準(zhǔn)確性統(tǒng)計(jì)也更加便利。新會(huì)計(jì)制度對(duì)會(huì)計(jì)核算內(nèi)容進(jìn)行了增加與調(diào)整，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了基建數(shù)據(jù)與會(huì)計(jì)“大賬”數(shù)據(jù)合并，進(jìn)一步完善了財(cái)政投入資金的會(huì)計(jì)核算，規(guī)范了非財(cái)政補(bǔ)助結(jié)轉(zhuǎn)、結(jié)余及其分配的會(huì)計(jì)核算，明確了資產(chǎn)計(jì)價(jià)和入賬計(jì)量原則，全面完善了科目體系和會(huì)計(jì)科目使用說明，進(jìn)一步完善了財(cái)務(wù)報(bào)表體系。提高了會(huì)計(jì)核算信息的及時(shí)性、準(zhǔn)確性。

1.2.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定提取溫度70℃，按L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝條件。

1.2.5 超聲波輔助提取[15]

1.2.5.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

稱取粒徑為0.8mm的馬鈴薯皮20.0g 5份，置于250mL錐形瓶中，加入pH3的70%乙醇100mL，70℃條件下，于超聲波清洗儀中超聲20min。固定其他條件，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(10%～95%)、超聲溫度(40～80℃)、超聲時(shí)間(10～40min)、pH值(用冰乙酸調(diào)節(jié)，1～5)、原料粒徑(0.2～0.8mm)、料液比(1：5～1：20)對(duì)提取效果的影響。其中探討乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響時(shí)固定的超聲溫度為65℃。

1.2.5.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、pH3，按L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙溶劑提取馬鈴薯龍葵素的工藝參數(shù)優(yōu)化

2.1.1 雙溶劑提取馬鈴薯龍葵素單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析圖1A顯示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，龍葵素的得率增大，當(dāng)提取時(shí)間為18h時(shí)，提取效果最好；提取時(shí)間再延長(zhǎng)，乙酸揮發(fā)增多，導(dǎo)致酸性過強(qiáng)，龍葵素結(jié)構(gòu)破壞，提取效果下降。圖1B表明，隨著提取溫度的升高，龍葵素得率增加，70℃時(shí)提取效果最好。溫度進(jìn)一步升高，得率呈下降趨勢(shì)，其原因可能是龍葵素結(jié)構(gòu)受到破壞。由圖1C可知，隨著料液比的增大，提取效果越好，當(dāng)料液比達(dá)到1：15后，料液比再增大，龍葵素的得率增加不明顯。從圖1D可看出，隨著提取料液pH值的降低，龍葵素得率增大，這是因?yàn)辇埧仫@弱堿性，于強(qiáng)酸下可形成鹽，溶解度增大；當(dāng)pH值達(dá)到3.2時(shí)，提取效果增加不再明顯，pH值達(dá)到2.9之后，酸性過強(qiáng)，龍葵素結(jié)構(gòu)被破壞，提取效果下降。圖1E表明，原料粒徑由大變小，龍葵素得率先增大后減少，粒徑為0.45mm時(shí)提取效果最好。原料經(jīng)粉碎后粒度變小，表面能增加，浸出速度加快，粒度越小，比表面能越大，浸出速度越快。但粉碎過細(xì)，樣品粉粒表面積過大，吸附作用增強(qiáng)，反而影響擴(kuò)散速度，并不利于有效成分的溶出。

圖 1 雙溶劑提取各單因素條件對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effect of single factors on extraction efficiency by dual solvent extraction

2.1.2 雙溶劑提取馬鈴薯龍葵素的正交試驗(yàn)

表 1 雙溶劑提取馬鈴薯龍葵素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Experimental design and results of orthogonal experiment for dual solvent extraction

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以龍葵素得率為考察指標(biāo)，選擇較優(yōu)因素，對(duì)雙溶劑提取時(shí)間(A)、料液比(B)、雙溶劑比(C)、原料粒徑(D)影響因素設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)(表1)。極差分析可知，4個(gè)因素對(duì)馬鈴薯龍葵素提取得率的影響大小依次為C＞D＞B＞A，即：乙醇乙酸比＞粒徑＞料液比＞時(shí)間。雙溶劑提取馬鈴薯龍葵素的最佳工藝為提取溫度70℃、提取時(shí)間17h、料液比1：20、乙醇乙酸比10：2(pH3.2)、原料粒徑0.3mm。

在上述最佳工藝參數(shù)條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，馬鈴薯龍葵素得率分別為0.6384%、0.6463%、0.6403%，平均得率為0.6417%。

2.2 超聲波輔助提取馬鈴薯龍葵素的工藝參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 超聲波輔助提取馬鈴薯龍葵素單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

由圖2A可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，龍葵素得率增加，增至70%后，提取效果反而下降。這主要是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)增大，溶劑極性變小，生物堿的浸出量相對(duì)減少。圖2B表明，超聲溫度升高，龍葵素得率增加，70℃時(shí)提取效果最好，但溫度進(jìn)一步升高，龍葵素結(jié)構(gòu)被破壞，得率呈下降趨勢(shì)。圖2C顯示，隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，龍葵素得率先增大后減少；超聲20min提取效果最好。超聲時(shí)間過長(zhǎng)，超聲波的機(jī)械、空化效應(yīng)可能破壞生物堿的結(jié)構(gòu)。由圖2D可知，當(dāng)料液pH值為3時(shí)，提取得率最高。圖2E表明，超聲波輔助提取馬鈴薯龍葵時(shí)，原料粒徑為0.45mm時(shí)提取得率最高。圖2F顯示，隨著料液比的增大，提取效果越好，當(dāng)料液比達(dá)到1：10后，料液比再增大，龍葵素的得率增加不明顯。

圖 2 超聲波輔助提取各單因素條件對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of single factors on extraction efficiency by ultrasonic-assisted extraction

2.2.2 超聲波輔助提取馬鈴薯龍葵素的正交試驗(yàn)

表 2 超聲波輔助提取馬鈴薯龍葵素的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment of ultrasonic-assisted extraction

根據(jù)超聲波輔助提取馬鈴薯龍葵素的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以龍葵素得率為考察指標(biāo)，選擇較優(yōu)因素，對(duì)超聲溫度(E)、超聲時(shí)間(F)、料液比(G)、原料粒徑(H)影響因素設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)(表2)。極差分析可知，4個(gè)因素對(duì)馬鈴薯龍葵素提取得率的影響大小依次為H＞G＞E＞F，即：粒徑＞料液比＞超聲溫度＞超聲時(shí)間，其最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、pH3、超聲溫度65℃、提取時(shí)間20min、料液比1：15、原料粒徑0.3mm。

在上述最佳提取工藝技術(shù)組合條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，馬鈴薯龍葵素得率分別為0.6994%、0.7311%、0.7173%，平均得率為0.7159%。同時(shí)，每超聲提取一次，分離提取液與殘?jiān)?，殘?jiān)M(jìn)行下一次提取，依次進(jìn)行4次，檢測(cè)每一次龍葵素的提取得率(圖3)。圖3顯示，超聲提取兩次已達(dá)到基本提取完全的要求，龍葵素的累計(jì)得率達(dá)到0.8356%。

圖 3 超聲次數(shù)實(shí)驗(yàn)Fig.3 Effect of extraction times on extraction efficiency

2.3 不同提取方法提取馬鈴薯龍葵素的比較

表 3 不同提取方法提取馬鈴薯龍葵素的比較Table 3 Comparison of different extraction methods

由表3可知，在馬鈴薯龍葵素的乙醇回流提取、微波輔助提取、雙溶劑提取、超聲波輔助提取4種方法中，以超聲波輔助提取的得率最高，達(dá)到0.8356%。超聲波輔助提取與其他方法相比，具有提取時(shí)間短，提取條件較溫和、溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生有機(jī)溶劑由于沸點(diǎn)較低在短時(shí)間內(nèi)會(huì)急劇蒸發(fā)膨脹溢出以及過熱現(xiàn)象而導(dǎo)致的提取效果下降等缺點(diǎn)。

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯中龍葵素的含量極低，而馬鈴薯中的主要成分是淀粉，開發(fā)利用龍葵素需建立在淀粉開發(fā)利用的基礎(chǔ)上，才能達(dá)到資源的充分利用。通過實(shí)驗(yàn)建立高效、便捷、環(huán)保提取馬鈴薯龍葵素的方法，再對(duì)龍葵素進(jìn)行純化，得到較高純度的龍葵素產(chǎn)物，以利于高效液相色譜、高速逆流色譜等先進(jìn)設(shè)備分離得到高純度的龍葵素提取物或其單體，并對(duì)龍葵素單體進(jìn)行藥理藥效及高價(jià)值產(chǎn)品開發(fā)研究，將是今后馬鈴薯龍葵素研究的重點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)綜合比較研究了乙醇回流提取、微波輔助提取、雙溶劑提取、超聲波輔助提取4種方法對(duì)馬鈴薯龍葵素的提取效果，得出了馬鈴薯龍葵素的最佳提取方法及其工藝為超聲波輔助提取、70%乙醇、pH3、超聲溫度65℃、提取時(shí)間20min、料液比1：15、原料粒徑0.3mm、超聲兩次，龍葵素得率達(dá)到0.8356%；此方法相比與其他3種方法具有提取時(shí)間短、提取條件較溫和、溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)；為馬鈴薯龍葵素的高效、綠色工業(yè)化生產(chǎn)及高價(jià)值產(chǎn)品開發(fā)研究提供了科學(xué)依據(jù)和保障。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)利用160W 超聲波清洗儀進(jìn)行超聲波輔助提取實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)過程中未能考慮超聲波強(qiáng)度對(duì)馬鈴薯龍葵素提取效果的影響，這是實(shí)驗(yàn)局限之所在，對(duì)于相關(guān)科學(xué)問題，也尚有待于進(jìn)一步研究。

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