甘藍型油菜高效離體再生體系的建立

楊長友 袁中厚 鄭小敏 張濤

（重慶師范大學生命科學學院，重慶 401331）

油菜為十字花科蕓薹屬越年生或一年生植物，是世界四大油料作物之一，也是我國重要的油料作物之一，它在人類的生活和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著極其重要的作用。油菜的莖可以食用，油菜種子不僅可用來榨取食用油，還可用作飼料。同時油菜花具有一定的觀賞價值，可以用作旅游資源。另外，能源危機是當前全球面臨的重大難題之一，由于低芥酸菜籽油中的脂肪酸碳鏈組成為16-18個碳，與柴油分子碳數(shù)相近，且油菜種植范圍廣，屬于可再生資源，油菜被認為是生物柴油最理想的原料［1］。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在油菜育種中已獲得了廣泛的應(yīng)用，并得到了大量具有不同優(yōu)良特性的油菜種質(zhì)［2-6］。高效的植株再生體系是植物轉(zhuǎn)基因研究能否有效進行的前提條件。經(jīng)過多年研究，國內(nèi)外許多機構(gòu)已建立了成熟的油菜離體再生體系［7-10］。然而，研究表明，油菜不同基因型、不同外植體之間的最佳離體再生條件存在差異［11-14］，這在一定程度上阻礙了油菜轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展。本研究以甘藍型油菜HC8為材料，從苗齡、預培養(yǎng)基激素濃度、預培養(yǎng)天數(shù)、6-BA及NAA的濃度等方面探究該油菜品種的最佳離體再生條件，建立并優(yōu)化甘藍型油菜HC8的高頻率離體再生體系，進一步豐富油菜離體高效再生體系的相關(guān)試驗數(shù)據(jù)，為油菜組織培養(yǎng)提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)，并為進一步通過植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得預期優(yōu)良性狀的油菜新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘藍型油菜（Brassica napus L.）品系HC8由重慶師范大學生命科學學院細胞與遺傳學實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 培育方法

1.2.1.1 油菜無菌苗培育 挑選飽滿、大小均勻和無病蟲害的油菜種子，用無菌蒸餾水清洗種子，用75%乙醇消毒30 s，用無菌蒸餾水沖洗3-5次，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒8 min，之后再用無菌蒸餾水沖洗3-5次，并將種子浸泡于無菌蒸餾水中30 min以上。消毒之后將其接種于1/2 MS培養(yǎng)基上，于25-28℃、12 h光照/12 h黑暗條件下培養(yǎng)。

1.2.1.2 無菌苗苗齡對油菜外植體分化的影響 分別取培育不同天數(shù)（4、5、6和7 d）的油菜無菌苗，將子葉切成 0.5 cm2左右的小塊、下胚軸切成0.5 cm左右的小段，接種于MS+1.0 mg/L 2，4-D的預培養(yǎng)基上預培育5 d后，將生長良好的子葉外植體轉(zhuǎn)接入MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中、將生長良好的下胚軸外植體轉(zhuǎn)接入MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計再生頻率和分化頻率。

1.2.1.3 預培養(yǎng)時間對油菜外植體分化的影響 取培育5 d的油菜無菌苗，將子葉切成 0.5 cm2左右的小塊、下胚軸切成0.5 cm左右的小段，接種于MS+1.0 mg/L 2，4-D的預培養(yǎng)基上，分別預培育3、4、5和6 d后，取相應(yīng)預培育天數(shù)生長良好的子葉外植體轉(zhuǎn)接入MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中、生長良好的下胚軸外植體轉(zhuǎn)接入MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計再生頻率和分化頻率。

1.2.1.4 預培養(yǎng)基中不同濃度2，4-D對油菜外植體愈傷組織誘導及分化的影響 取培育5 d的油菜無菌苗，將子葉切成 0.5 cm2左右的小塊、下胚軸切成0.5 cm左右的小段，接種于含有不同濃度2，4-D的MS培養(yǎng)基上，預培育5 d后，將生長良好的子葉外植體轉(zhuǎn)接入MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中、生長良好的下胚軸外植體轉(zhuǎn)接入MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中，15 d后統(tǒng)計愈傷誘導率，30 d后統(tǒng)計再生頻率和分化頻率。

1.2.1.5 誘導培養(yǎng)基中不同濃度6-BA及NAA對油菜外植體愈傷組織誘導及分化的影響 取培育5 d的油菜無菌苗，將子葉切成 0.5 cm2左右的小塊、下胚軸切成0.5 cm左右的小段，接種于MS+1.0 mg/L 2，4-D的預培養(yǎng)基上預培育5 d后，將生長良好的外植體（子葉、下胚軸）轉(zhuǎn)接入含有不同濃度6-BA和NAA的分化培養(yǎng)基中，15 d后統(tǒng)計愈傷誘導率，30 d后統(tǒng)計再生頻率和分化頻率。

1.2.1.6 生根培養(yǎng)基中不同濃度NAA對油菜苗生根的影響 取生長到 2-3 cm 的不定芽，接種到含不同濃度NAA的培養(yǎng)基上誘導生根。20 d后統(tǒng)計生根率和平均得根數(shù)。

1.2.2 培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件 無菌苗萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2 MS；預培養(yǎng)基為MS+2，4-D（0.5、1.0和1.5 mg/L）；愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA（1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/L）+NAA（0、0.05、0.1、0.2和0.3 mg/L）+3.5 mg/L AgNO3，共25個處理，芽誘導培養(yǎng)基和愈傷組織誘導培養(yǎng)基成分相同；生根培養(yǎng)基為MS+NAA（0、0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 mg/L）。所有培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30 g/L、瓊脂濃度為7 g/L，pH為5.8-6.0，培養(yǎng)溫度為25-28℃，光照條件為12 h光照/12 h黑暗。

1.2.3 試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析方法 試驗采用單因素試驗設(shè)計，每個處理重復3次，接種后每隔2 d觀察外植體的變化。試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行相應(yīng)的統(tǒng)計分析，平均數(shù)之間差異顯著性比較采用LSD法，柱形圖和折線圖均在Excel2003電子表格下制作。

愈傷誘導率（%）=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

再生頻率（%）=長芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)× 100%

分化頻率（%）=再生不定芽總數(shù)/接種外植體總數(shù)× 100%

生根率（%）=長根的苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 無菌苗苗齡對油菜外植體分化的影響

不同苗齡的油菜外植體（子葉、下胚軸）的再生頻率及分化頻率存在一定差異。在油菜苗齡為5 d時，子葉、下胚軸的再生頻率及分化頻率均達到最大，子葉的再生頻率及分化頻率分別為85.26%和100%；下胚軸的再生頻率及分化頻率分別為80.85%和96.75%。

2.2 預培養(yǎng)時間對油菜外植體分化的影響

預培養(yǎng)時間對油菜外植體的再生頻率及分化頻率均表現(xiàn)有不同程度的影響。預培養(yǎng)的子葉和下胚軸的分化效果較好，分化頻率分別為80.20%和83.0%。方差分析結(jié)果表明，預培養(yǎng)5 d后子葉和下胚軸的分化頻率與其他預培養(yǎng)天數(shù)的相比差異顯著，而再生頻率與其他天數(shù)的相差不大。因此預培養(yǎng)5 d有利于油菜外植體的分化。

2.3 預培養(yǎng)基中不同濃度2, 4-D對油菜外植體分化的影響

油菜外植體經(jīng)不同濃度2，4-D處理后的分化情況存在顯著差異。當2，4-D濃度為1.0 mg/L-1時，子葉、下胚軸的再生頻率均達到最大，分別為87.52%和80.15%；二者的分化頻率也均為最大，分別為120.50%和102.45%。

2.4 誘導培養(yǎng)基中不同濃度6-BA及NAA對油菜外植體愈傷組織誘導及分化的影響

在不同激素組合處理條件下，油菜外植體愈傷組織形成情況差異較大。子葉在6-BA（1.0、2.0、3.0和4.0 mg/L） + NAA（0.05和0.1 mg/L）8個激素組合處理條件下，愈傷組織形成情況較好，愈傷組織生長較快（圖1-A）；下胚軸在6-BA（1.0、2.0、3.0和4.0 mg/L）+NAA 0.05 mg/L 4個激素組合處理條件下，愈傷組織形成情況較好，愈傷組織生長較快（圖1-B）。同時，從圖2中可以看出，在6-BA濃度為1-4 mg/L、NAA濃度為0.05-0.1 mg/L條件下，子葉愈傷誘導率可達到100%；下胚軸在6-BA濃度為1-4 mg/L、NAA濃度為0.05 mg/L條件下，愈傷誘導率在90.0%左右。因此，油菜子葉愈傷組織誘導的適宜6-BA濃度為1-4 mg/L，適宜NAA濃度為0.05-0.1 mg/L；下胚軸愈傷組織誘導的適宜6-BA濃度為1-4 mg/L，適宜NAA濃度為0.05 mg/L。

誘導培養(yǎng)基中不同濃度6-BA及NAA對油菜愈傷組織分化的影響也較大。在本研究所設(shè)的激素條件下，子葉愈傷組織在大多數(shù)激素組合條件下均可分化出不定芽（圖1-C），下胚軸愈傷組織在部分激素組合條件下也可分化出不定芽（圖1-D）。而在有些激素組合條件下，雖可誘導愈傷組織形成，但不能誘導芽的形成。

由圖3可知，在2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA及3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的組合條件下子葉愈傷組織的再生頻率和分化頻率均較高，兩者的再生頻率分別為88.0%和83.33%，兩者的分化頻率分別為104.0%和108.33%。方差分析結(jié)果表明，以上兩個激素組合條件下子葉愈傷組織的再生頻率及分化頻率差異均不顯著。從圖4可以看出，在4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA的組合條件下下胚軸愈傷組織的再生頻率和分化頻率均為最高，分別為81.82%和104.55%，且與其他組合差異較大。因此，油菜子葉愈傷組織不定芽誘導的最佳激素組合為2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA及3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，油菜下胚軸愈傷組織不定芽誘導的最佳激素組合為4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。

2.5 生根培養(yǎng)基中不同濃度NAA對油菜苗生根的影響

不同濃度NAA條件下油菜苗的生根率及平均得根數(shù)如圖5所示。與不施加NAA的條件相比，施加NAA可以顯著影響油菜苗的生根情況，而且不同NAA濃度下的油菜苗生根情況也存在差異，當NAA濃度為0.5 mg/L時油菜苗的生根率及平均得根數(shù)均達到最大值，分別為90.0%和21.6（根）。另外，在0.5 mg/L NAA條件下，油菜苗生根較快，根較粗，根系較發(fā)達（圖1-D）。因此，油菜苗生根的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA。

3 討論

本研究表明，較高的6-BA濃度及較低的NAA濃度有利于油菜愈傷組織的誘導及分化，這與前人的研究結(jié)果類似［15］。然而通過比較發(fā)現(xiàn)，子葉和下胚軸對不同濃度6-BA及NAA的敏感性存在一定差異，下胚軸比子葉更為敏感。這可能是由于子葉和下胚軸的內(nèi)源激素含量存在差異以及兩者對外源激素的吸收能力不同，具體原因有待進一步研究。另外，誘導培養(yǎng)基中加入AgNO3是為了促進油菜愈傷組織形成不定芽。在愈傷組織形成過程中外植體會產(chǎn)生大量乙烯，而乙烯對芽的形成有一定的抑制作用，Ag+可與乙烯競爭作用部位，減弱乙烯的抑制作用，從而間接地促進油菜愈傷組織形成不定芽，提高油菜再生頻率及分化頻率［16，17］。已有研究表明［7，8，18］，促進油菜愈傷組織形成不定芽的適宜AgNO3濃度為5 mg/L。由于品種差異，本試驗的AgNO3濃度選擇為3.5 mg/L。

4 結(jié)論

本試驗通過對甘藍型油菜HC8的離體再生研究，成功建立了油菜HC8的高效離體再生體系。其組織培養(yǎng)最佳苗齡為5 d；最佳預培養(yǎng)時間為5 d，最適2，4-D濃度為1.0 mg/L；子葉最適誘導培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3或MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3；下胚軸最適誘導培養(yǎng)基為MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3；最佳生根培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA。

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