烏雞白鳳丸抗肝纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究＊

王 萍 郭雪艷 王芳婷 牛建平 朱云清 陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)科（西安710068）

肝纖維化甚至肝硬化是慢性肝病發(fā)展演變的過(guò)程，臨床表現(xiàn)為乏力、食欲不振、惡心、嘔吐、黃疸、腹水等，僅能采取對(duì)癥處理，目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏理想的抗肝纖維化及其進(jìn)展的藥物。臨床上我們發(fā)現(xiàn)，在某些肝纖維化或肝硬化患者的治療中烏雞白鳳丸可部分改善患者的腹脹、乏力等癥狀，使肝功好轉(zhuǎn)，為臨床治療肝纖維化甚至肝硬化提供了一種新治療方法。為了進(jìn)一步研究、探討烏雞白鳳丸在抗肝纖維化中的作用及其機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)并進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 試驗(yàn)藥物 烏雞白鳳丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z11020091 批號(hào)：20120501）加蒸餾水碾勻溶解，配成濃度為720g／L 的藥液備用。四氯化碳分析純（Carbon tetrachloride，CCl4）、橄欖油及秋水仙堿均購(gòu)自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司。秋水仙堿用生理鹽水配制濃度為1mg／mL。采用橄欖油將四氯化碳配制成濃度為30%的四氯化碳橄欖油，做為Wistar大鼠肝硬化的造模劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)大鼠 Wistar大鼠雌雄各半共90只，體重170～200g，年齡6～8周，全部購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)大鼠分組 共有90只Wistar大鼠，隨機(jī)平均分為A 組（正常對(duì)照組）：不要任何藥物；B組（模型對(duì)照組）：僅用30%CCL4橄欖油注射于大鼠腹腔內(nèi)（每100g 0.2mL）制備肝纖維化模型；C 組（蒸餾水治療組）：在上述制備肝纖維化模型過(guò)程中，同時(shí)給予蒸餾水10mL／（kg.d），灌胃；D 組（秋水仙堿治療組）在上述制備肝纖維化模型過(guò)程中，同時(shí)給予秋水仙堿液按1mg／（kg.d）灌胃；E組（烏雞白鳳丸治療組）：在上述制備肝纖維化模型過(guò)程中，同時(shí)給予烏雞白鳳丸10 mL／（kg.d）灌胃，1d1次。實(shí)驗(yàn)過(guò)程共8周。平均每組18只，雌雄各半。

1.4 鼠抗人α－SMA 單克隆抗體（1∶200）購(gòu)自Santa Cruz公司（美國(guó)），山羊抗鼠II抗、即用型SABC 試劑盒、DAB 顯色試劑盒等均購(gòu)自西安沃爾森生物技術(shù)公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 肝纖維化大鼠模型的制備 按照文獻(xiàn)［1］報(bào)道用30% CCL4橄欖油注射于大鼠腹腔內(nèi)（每只100g 0.2mL），每周2次，共8周。

2.2 標(biāo)本的采集 8周后，對(duì)各組大鼠用1%戊巴比妥鈉（40mg／kg）行腹腔注射麻醉。無(wú)菌條件下對(duì)大鼠的心臟采血，分離其血清，置－20℃保存。同時(shí)摘取大鼠肝臟左葉用石蠟包埋，制作成石蠟切片，行組織病理學(xué)檢查。

2.3 血清學(xué)檢查及病理學(xué)檢查 自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血中ALT、AST，用放免方法檢查透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層粘連蛋白（laminin，LN）、III型膠原（PC－III）的濃度，ELISA 方法檢測(cè)血清中TGF－β、TNF－α的水平。

病理學(xué)采用肝臟組織常規(guī)石蠟切片HE 染色。在光鏡下觀察按照肝纖維化半定量計(jì)分系統(tǒng)（SSS）方法［2］，由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師對(duì)所有切片進(jìn)行盲法觀察，并按SSS方法對(duì)所有對(duì)各組大鼠肝纖維化程度評(píng)分。最高29分，最低0分；得分越高，表示纖維化程度越重。

2.4 免疫組織化學(xué) 采用SABC 法，常規(guī)脫蠟水化；PBS漂洗；抗原修復(fù)；加入α－SMA 抗體（1：200），4℃過(guò)夜封閉；滴加二抗抗體；DAB顯色，封片。用正常血清作陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，采用專業(yè)多媒體圖文分析系統(tǒng)技術(shù)每個(gè)視野中陽(yáng)性部分及棕黃色的總像素占視野總像素值的比例，作為活化肝星狀細(xì)胞（HSC，hepatic stellate cell）在肝組織中所占的比例。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA），以P ＜0.05為差異有顯著性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1 血清學(xué)結(jié)果 見(jiàn)表1。烏雞白鳳丸治療組（E 組）及秋水仙堿治療組（D 組）血清ALT、AST、HA、LN、PCIII、TNF－α、TGF－β含量較蒸餾水處理組（C 組）、模型對(duì)照組（B組）降低，而較正常對(duì)照組（A）高，通過(guò)單因素方差分析，各組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。但烏雞白鳳丸處理組（E組）與秋水仙堿處理組（D 組）比較以上各組血清學(xué)數(shù)值無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組指標(biāo)結(jié)果比較（±s）

表1 各組指標(biāo)結(jié)果比較（±s）

①烏雞白鳳丸處理組（E組）、秋水仙堿處理組（D 組）及正常對(duì)照組（A 組）分別與模型組（B組）及蒸餾水處理組（C 組）比較：ΔP ＜0.05。②烏雞白鳳丸處理組（E組）與秋水仙堿處理組（D 組）比較：▲P＞0.05。

指 標(biāo)A 組B組C組D 組E組ALT（U／L）40.45±8.10Δ270.40±70.12 267.31±72.51 85.46±29.47Δ81.32±30.12Δ▲AST（U／L）320.15±56.17Δ560.12±50.17 555.35±53.45 320.25±65.18Δ340.17±55.36Δ▲HA（ng／mL）120.13±30.15Δ340.42±72.80 335.12±40.70 190.72±38.72Δ180.52±40.12Δ▲LN（ng／mL）170.15±20.13Δ360.72±30.18 360.12±29.75 260.13±30.40Δ240.12±20.12Δ▲PC－III（pg／mL）0.190±0.007Δ0.415±0.008 0.410±0.009 0.198±0.005Δ0.172±0.007Δ▲TNF－α（pg／mL）0.2510±0.072Δ0.568±0.008 0.565±0.004 0.245±0.004Δ0.256±0.003Δ▲TGF－β（pg／mL）0.182±0.005Δ0.651±0.007 0.650±0.005 0.175±0.006Δ0.187±0.003Δ▲SSS評(píng)分0.042±0.045Δ25.350±4.125 25.423±4.215 5.135±1.354Δ5.005±1.025Δ▲圖像分析（%）0.512±0.456Δ7.348±1.245 7.285±1.365 0.802±0.415Δ0.792±0.528Δ▲

3.2 HE染色 正常組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞大小均勻，無(wú)變性、壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)存在，小葉內(nèi)肝細(xì)胞索排列較整齊，偶見(jiàn)雙核肝細(xì)胞；模型組肝細(xì)胞及蒸餾水處理組肝細(xì)胞可見(jiàn)明顯脂肪變性、氣球樣變性，多分布于界板周圍，可見(jiàn)較多雙核肝細(xì)胞，匯管區(qū)纖維組織明顯增生，部分肝小葉結(jié)構(gòu)存在；烏雞白鳳丸處治療組脂肪變性和氣球樣變性明顯減輕，纖維組織增生不明顯。

3.3 α－SMA 免疫組化染色 顯微鏡下重點(diǎn)觀察黃色膠原纖維分布情況。正常組（A 組）僅于血管周圍可見(jiàn)少量黃色纖維，細(xì)且短；肝纖維化模型組（B組）肝臟組織中纖維明顯增多，分布廣泛，可相互連接形成較粗大的纖維間隔，多位于匯管區(qū)和血管周圍；烏雞白鳳丸處理組（E 組）僅見(jiàn)少量較細(xì)的黃色纖維表達(dá)于炎細(xì)胞浸潤(rùn)、聚集區(qū)，纖維間隔區(qū)，及靠近纖維間隔的血竇區(qū)，匯管區(qū)的血管壁，見(jiàn)圖。

圖像分析顯示：B組α－SMA 抗體陽(yáng)性率最高；A 組最少；烏雞白鳳丸治療組的陽(yáng)性率較B和C組明顯減低，接近秋水仙堿治療組，見(jiàn)表1。

3.4 SSS計(jì)分結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠纖維化明顯（P ＜0.01）。與模型對(duì)照組相比，烏雞白鳳丸治療組（E組）及秋水仙堿性治療組（D 組）肝纖維化SSS計(jì)分明顯下降，示烏雞白鳳丸治療組肝纖維化程度明顯減低（ΔP ＜0.05）。而E組與D 組比較，肝纖維化計(jì)分無(wú)明顯差異（▲P＞0.05），見(jiàn)表1。

組織切片α－SMA 免疫組化染色正常組

α－SMA 免疫組化染色肝纖維化模型組

α－SMA 免疫組化染色烏雞白鳳丸治療組

4 討 論 肝纖維化是慢性肝病進(jìn)展演化的主要途徑，同時(shí)也是肝炎逐步轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌的必經(jīng)途徑。目前肝硬化及肝纖維化機(jī)制比較復(fù)雜，得到公認(rèn)的如下各種因素共同作用導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，激活庫(kù)普弗細(xì)胞，并隨同內(nèi)皮細(xì)胞及肝細(xì)胞等分泌各種細(xì)胞因子如TGF－β、TNF－α、PDGF、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、纖維生長(zhǎng)因子（FGF）等及某些化學(xué)介質(zhì)，共同作用于靜息狀態(tài)肝臟星型細(xì)胞（HSC）并使其激活，并通過(guò)自分泌和旁分泌作用使HSC 增殖，合成分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM ），并且抑制ECM 降解，造成ECM 過(guò)量沉積，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)改變，肝纖維化及肝硬化發(fā)生。靜止的HSC 不表達(dá)α－SMA，活化的HSC具有平滑肌細(xì)胞的特性，表達(dá)α－平滑肌肌動(dòng)蛋白（α－SMA），具有收縮功能，因而α－SMA 可作為HSC 活化的標(biāo)志［3］，并對(duì)肝臟的纖維化程度進(jìn)行評(píng)估。

通過(guò)各種研究及文獻(xiàn)報(bào)道，目前臨床上以LN、HA、PCIII定位反應(yīng)作為肝纖維化及肝損害的定量標(biāo)志物［4］。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們采用放免法對(duì)血清中TGF－β、TNF－α及HA、LN、PCIII的水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在肝纖維化形成過(guò)程中，以上因子的水平均顯著升高，但通過(guò)烏雞白鳳丸處理組的各項(xiàng)指標(biāo)均較模型組明顯減低，且目前多重實(shí)驗(yàn)已證明秋水仙堿在肝纖維化形成中有保護(hù)作用，本組實(shí)驗(yàn)烏雞白鳳丸組與秋水仙堿處理組比較無(wú)明顯差異。說(shuō)明烏雞白鳳丸在肝纖維化演變中，對(duì)TGF－β、TNF－α及HA、LN、PCIII均有顯著地下調(diào)，同時(shí)從病理學(xué)方向，觀察到烏雞白鳳丸治療后α－SMA 表達(dá)水平明顯下降，進(jìn)一步說(shuō)明烏雞白鳳丸可部分抑制肝星狀細(xì)胞的活性，減少肝纖維化過(guò)程中假小葉的形成，改善肝臟結(jié)構(gòu)。分別從血清學(xué)及組織病理學(xué)水平證明了烏雞白鳳丸在大鼠肝纖維化形成中具有一定的保護(hù)作用，一定程度上延緩了肝纖維化進(jìn)程。

而同仁堂烏雞白鳳丸的原始配方源自明代龔?fù)①t撰《壽世保元》中的白鳳丹、烏雞丸。傳統(tǒng)功效為補(bǔ)氣養(yǎng)血、調(diào)經(jīng)止帶，用于氣血兩虛、身體瘦弱、腰膝酸軟。是一種經(jīng)典的治療婦科疾病的傳統(tǒng)中藥。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道［6］發(fā)現(xiàn)在臨床實(shí)踐中烏雞白鳳丸早期肝硬化有作用，且安全性能良好。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們觀察到烏雞白鳳丸在大鼠肝纖維化形成中有一定的保護(hù)作用。

另有研究［7］表明烏雞白鳳丸具有增強(qiáng)臟解毒功能，促進(jìn)肝糖元和蛋白質(zhì)的新代謝，從而對(duì)肝損傷起保護(hù)作用，且有調(diào)整體內(nèi)免疫和細(xì)胞免疫功效，這對(duì)減輕肝細(xì)胞損害，促進(jìn)肝功能好轉(zhuǎn)均有積極作用，對(duì)肝硬化、纖維化有抑制作用。

如何利用祖國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)藥烏雞白鳳丸，進(jìn)行老藥新用，使其在肝病治療領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用是我們今后臨床工作的方向之一。

［1］ 苗明山.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1997：226.

［2］ 曾民德，王泰齡，王寶恩.肝纖維化診斷及療效評(píng)估共識(shí)［J］.肝臟，2002，7（2）：3.

［3］ Milani S，Herbst H，Schuppan D et al.Cellular location of laminin gene transcripts in normal and fibrotic human liver［J］.Am J Pathol，1989，134：1175－1182.

［4］ Esmat G，Metwally M，Zalata KR，et al.Evaluationg of serum biomarkers of fibrosis and injury in Egyptian patients with chronic hepatitis C［J］.Hepatal，2007，46（4）：620－627.

［5］ Yin MF，Lian LH，Piao DM，et al.Tetrandrine stimulates the apoptosis of hepatic stellate cells and ameliorates development of fibrosis in a thioacetamide rat model.World［J］.Gastroentrol，2007，13（8）：1214－1220

［6］ 劉洪明，畢青，張俊富.烏雞白鳳丸對(duì)肝硬化白蛋白的影響［J］.天津中醫(yī)藥2003，20（1）：29.

［7］ 李曉芹，賀 蓉，周愛(ài)香，等.烏雞白鳳丸口服液及丸劑對(duì)中毒性肝損傷影響的比較［J］.中藥藥理與臨床，2000，16（4）：1－2.