針灸聯(lián)合中藥通過抑制胰島細(xì)胞的凋亡發(fā)揮對糖尿病大鼠的治療作用＊

胥 冰 劉 娟 田 磊 馬曉軍 陜西中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系（咸陽712046）

糖尿?。╠iabetes）是由遺傳因素、免疫功能紊亂等各種因素作用于機體導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征。糖尿病人表現(xiàn)為血糖升高，胰島素的水平降低，其發(fā)病機制可能和胰島β細(xì)胞的凋亡相關(guān)。糖尿病在中醫(yī)稱之為消渴，古代醫(yī)家在論述消渴病機時大多以陰虛燥熱立論，陰虛為本，燥熱為標(biāo)。因此中醫(yī)治療糖尿病多采用滋陰清熱、生津、滋腎等法。白芍苦酸微寒，養(yǎng)血斂陰，甘草舒筋活絡(luò)，酸甘化陰，二藥合用共奏養(yǎng)陰生津，潤燥清熱之效。近來采用毫針刺，電針、艾灸、穴位注射等針灸方法治療糖尿病也取得了較好的療效［1］。但是白芍、甘草或者針灸治療糖尿病的機制尚未闡明，它們是否通過調(diào)節(jié)bcl－2mRNA 的表達促胰島細(xì)胞生存，延長胰島細(xì)胞壽命，抑制細(xì)胞的凋亡對胰島細(xì)胞發(fā)揮保護作用目前尚不清楚。本研究采用腹腔注射STZ 復(fù)制糖尿病大鼠模型，觀察針灸或白芍、甘草對糖尿病大鼠胰島細(xì)胞損傷的影響及其機制，以探討其治療糖尿病的作用機制。

材料和方法

1 動 物 健康SD 大鼠雌雄各半50只，4～6周齡，體重200±10g，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK（陜）2007～001。各組大鼠分籠飼養(yǎng)，術(shù)前12h禁食，不禁水，室溫飼養(yǎng)。

2 藥品、試劑和儀器 鏈脲佐菌素（STZ），購于sigmaaldrich公司（D130）；葡萄糖測定試劑盒GOD－PAP法購于上海榮盛生物技術(shù)有限公司；胰島素測定試劑盒（FINS）購于上海榮盛生物技術(shù)有限公司；Bcl－2免疫組化SABC 試劑盒，購于上海微晶生物技術(shù)有限公司；白芍和甘草均選用生藥，將二藥兩次煎煮后的藥液分別過濾，合并濾液，濃縮制成100%（W／V）濃度，相當(dāng)于1g／mL 生藥置4℃保存?zhèn)溆?。蔡氏顯微鏡（德國產(chǎn)）、723分光光度計（上海光譜儀器公司）、高速冷凍離心機（日立）。

3 實驗動物分組及造模 健康SD 大鼠雌雄各半50只（4～6周齡，體重200±10g），適應(yīng)性喂養(yǎng)1w 后，隨機分為5組（n＝10）：空白組；模型組；針灸治療組；中藥治療組；針灸＋中藥組。除空白組外，其余各組大鼠經(jīng)腹腔注射STZ（45mg／kg，1次）［1］，72h后，測定大鼠空腹血糖，選取血糖≥11.1mmol／L 的大鼠為造模成功。

4 治療方法 空白組，普通飼料喂養(yǎng)8周后，一次性腹腔注射PH4.2，0.1moL／l檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖溶液。針灸組?、俜斡?、胰俞、脾俞及腎俞；②關(guān)元、中脘、三陰交、足三里。第一組均向脊柱方向斜刺入0.5～0.8cm，第二組均垂直進針，0.2～0.5cm，至針下沉緊后，行捻轉(zhuǎn)補法（小幅度快速捻轉(zhuǎn)10s），留針30min，每隔10min行針1次，1次／d，出針前再行補法（手法同前）［1］；第一天針刺第一組穴位，第二天用第二組穴位治療，兩組穴位隔天交替針刺8個療程（6d為1療程）；中藥組給予白芍甘草湯灌胃（10mL／kg，1次／d）7w。針灸＋中藥組在針灸同時聯(lián)合白芍甘草湯灌胃。

5 標(biāo)本采集與檢測 各組動物于7w 后麻醉處死，于空腹12h后將各組大鼠用10%戊巴比妥麻醉，心臟采血，5mL／只。采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖（FBG）；采用放射免疫法測定FINS含量，剖腹取胰腺和肝臟，取胰腺組織采用SABC 法（抗生物素過氧化物酶復(fù)合物法）技術(shù)檢測大鼠胰腺組織中Bcl－2mRNA 的表達變化。

5.1 空腹血糖測定 采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖（FBG）。

5.2 血清中胰島素水平檢測 空腹12h后于大鼠眼眶采取靜脈血測定，采用放射免疫法測定FINS含量。

5.3 胰腺組織中bcl－2mRNA 基因蛋白的表達變化檢測 采用SABC法（抗生物素過氧化物酶復(fù)合物法）染色，并按照試劑盒說明操作進行檢測。用Olympus BH－2顯微鏡觀察并攝片，采用病理圖像分析系統(tǒng)對染色結(jié)果進行半定量檢測。

實驗結(jié)果

1 血糖水平的變化 如圖1所示，模型組血糖的水平明顯升高，與空白組比較有顯著性差異（P＝0.0033，P ＜0.01）；而針灸＋中藥組血糖的水平明顯降低，與模型組相比差異具有顯著性（P＝0.057，P ＜0.01）；針灸治療組或中藥治療組雖然血糖的水平降低，但是與模型組相比差異無顯著性。

2 血清胰島素水平的變化 如圖2所示，模型組血中胰島素的水平明顯降低、與空白組比較有顯著性差異（P ＜0.01）；而針灸＋中藥組血中胰島素的水平明顯升高，與模型組相比差異具有顯著性（P ＜0.01）；針灸治療組或中藥治療組雖然血中胰島素的水平升高，但是與模型組相比差異無顯著性。

圖1 各組血糖的變化

圖2 各組血胰島素的變化

3 胰腺組織bcl－2mRNA 的表達變化 如圖3、圖4所示，模型組胰腺bcl－2的表達顯著降低，與空白組比較有顯著性差異（P ＜0.01）；而針灸＋中藥組胰腺bcl－2的表達顯著增加，與模型組相比差異具有顯著性（P ＜0.05）；針灸治療組或中藥治療組胰腺bcl－2的表達增加，但是與模型組相比差異無顯著性。

圖3 各組胰腺組織bcl－2的變化

圖4 各組胰腺組織bcl－2的變化

討 論 腹腔內(nèi)注射STZ復(fù)制大鼠糖尿病，是研究糖尿病較為理想的動物模型之一。我們經(jīng)大鼠腹腔注射STZ（45mg／kg，1次），72h后測定大鼠空腹血糖，其中80%以上血糖值≥11.1mmol／L。提示腹腔內(nèi)注射STZ（45mg／kg，1 次），成功復(fù)制了大鼠糖尿病模型。盡管糖尿病的病因及發(fā)病機制尚未完全明了，國內(nèi)外研究一般認(rèn)為胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能受損是糖尿病兩個最重要的發(fā)病因素。就目前對其發(fā)病機制的研究來看，β細(xì)胞功能衰退在其發(fā)病中起了決定性的作用，胰島β細(xì)胞損傷是糖尿病的重要發(fā)病機制［2］。在細(xì)胞凋亡的過程中，bcl－2是重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，在糖尿病的形成過程中起有重要作用。bcl－2 是B 細(xì)胞淋巴瘤／白血病－2 基因（B－celllymphoma leukemia－2）的縮寫，是bcl－2家族成員中主要的抗凋亡因子，在抵抗細(xì)胞凋亡及延長細(xì)胞壽命方面的作用最具代表性，在胰島細(xì)胞凋亡過程中Bcl－2mRNA 表達水平降低，促進了凋亡發(fā)生。而Bcl－2 基因轉(zhuǎn)染的胰島β細(xì)胞則能防止細(xì)胞因子誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡。在人體，高血糖能夠抑制胰島素的釋放并增加胰島β細(xì)胞凋亡，這種作用與葡萄糖濃度呈現(xiàn)一種劑量依賴的模式，高葡萄糖通過改變bcl家族之間的平衡，使β細(xì)胞產(chǎn)生釋放白介素1β，導(dǎo)致凋亡通路的激活（NF－KB 激活，F(xiàn)AS上調(diào)，DNA 破碎），促使β細(xì)胞凋亡［3］。而bcl－2 可以直接或間接阻止影響凋亡蛋白酶激活的關(guān)鍵因素細(xì)胞色素C 從線粒體釋放，并能抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，阻止細(xì)胞凋亡。近年來，中醫(yī)藥在防治糖尿病方面表現(xiàn)出巨大的潛力，無論是單味中藥還是中藥復(fù)方，在治療糖尿病方面均顯示出很大優(yōu)勢［4，5］。有研究表明，中藥復(fù)方能夠上調(diào)糖尿病大鼠凋亡抑制基因bcl－2表達，從而抑制糖尿病胰腺β細(xì)胞的凋亡，促細(xì)胞生存，延長細(xì)胞壽命。針灸也可有效抑制2型糖尿病胰島β細(xì)胞凋亡。我們分別采用針刺、白芍＋甘草及針刺聯(lián)合白芍甘草對STZ誘導(dǎo)的大鼠糖尿病進行治療發(fā)現(xiàn)：針刺＋中藥可以有效提高血中胰島素的水平，降低血糖水平，改善胰島的病理損傷。另外，我們還發(fā)現(xiàn)針刺＋中藥可以從mRNA 水平增強胰腺bcl－2的表達，提示針刺聯(lián)合中藥能有效促進胰島素分泌，發(fā)揮降血糖的功效。其機制可能與調(diào)節(jié)Bcl－2的表達從而抑制胰島細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

［1］ 梁興倫，韓明向.胰島素抵抗模型大鼠的中醫(yī)證候研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，7：528.

［2］ 楊立勇，吳佩文.細(xì)胞因子介導(dǎo)的2型糖尿病β細(xì)胞損傷機制［J］.國外醫(yī)學(xué)內(nèi)分泌學(xué)分冊，2005，25（1）：13－15.

［3］ Piro S，AnelloM，Di Pietro C，et al.Chronic exposure to free fatty acid or high glucose induces apoptosis in rat pancreatic islets：possible role of oxidative stress.Metabolism，2002，51：1340－1347.

［4］ 臧樂紅，楊玉青.針刺聯(lián)合直流電藥物離子導(dǎo)入治療糖尿病性眼肌麻痹31例［J］.陜西中醫(yī)，2012，33（5）：588－589.

［5］ 林 瑛，閆林西.參芪地黃散配合西藥治療2型糖尿病療效觀察［J］.陜西中醫(yī)，2012，33（4）：418－419.