HPLC法測(cè)定30個(gè)蕎麥品種蘆丁含量的研究

郭 彬，韓淵懷，黃可盛，路 陽，侯思宇

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程研究所，山西太谷030801）

蕎麥屬蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill），品種主要有甜蕎（F.esculentum Goerth）和苦蕎（F. tararicum Gaerth）2個(gè)栽培種以及金蕎麥（F.dibotrys（D.Don）Hara）1個(gè)野生種[1-2]。蕎麥屬于藥食兩用植物[3]，其含有極為豐富的天然生物活性成分黃酮類物質(zhì)——蘆丁[4]。蘆?。╭uercetin 3-O-b-D-glucose-[1，6]-O-a-L-rhamnose，rutin）又稱維生素P，是某些中草藥的有效成分，具有抗紫外線、抗血栓形成、糖尿病輔助治療、降低毛細(xì)管通透性和脆性以及癌癥的輔助治療等作用[5-6]。國內(nèi)外醫(yī)藥工業(yè)已經(jīng)成功開發(fā)了曲克蘆丁、維腦路通（羥乙蘆?。┑纫蕴J丁為主要原料的藥物，并在臨床治療上取得了良好效果[7]。目前，我國用于蘆丁提取的原料主要為槐米，而槐米因原料不足，已遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，開發(fā)多元化的蘆丁來源，補(bǔ)充市場(chǎng)需求尤為重要。蕎麥生長期短（70～90 d），抗逆性強(qiáng)，一年四季均可種植[8]，這些特性為蕎麥成為蘆丁的來源提供了可能。

本研究共選取30個(gè)不同產(chǎn)地的甜蕎和苦蕎品種，對(duì)其花、葉、莖組織中的蘆丁含量進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步培育高蘆丁含量的蕎麥品種、加快蕎麥蘆丁相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 植物材料

30個(gè)蕎麥品種由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小雜糧研究中心提供（表1）。5月20日播種于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站，盛花期分別選取適量健康花、葉與莖組織于培養(yǎng)皿中，80℃烘箱干燥10 h。將干燥后的組織置于研缽中研成粉末，并精確稱取0.1 g組織，待用。

1.2 儀器與試劑

安捷倫Series1100高效液相色譜儀（美國）；賽多利斯電子分析天平（德國）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣（Sigma，純度≥95%）；甲醇為色譜純（Fisher，美國）；實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

表1 不同蕎麥品種

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

安捷倫C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱溫30℃，流動(dòng)相為甲醇∶水（V/V）＝46∶54，流速1 mL/min，進(jìn)樣量5μL，檢測(cè)波長257 nm，按上述色譜條件分析，每個(gè)樣品重復(fù)3次。對(duì)照品與九江苦蕎色譜如圖1所示。

2.2 對(duì)照品溶液配制及線性關(guān)系考察

精密稱取經(jīng)減壓干燥的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g，加入10 mL甲醇定容至質(zhì)量濃度為5 mg/mL的母液。精確吸取10μL母液，加入1 mL甲醇，稀釋成50μg/mL，依此類推，將標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋成50～400μg/mL質(zhì)量濃度梯度。按2.1色譜條件上樣測(cè)定峰面積，按照峰面積（x）與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度（y）計(jì)算線性回歸，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）：y＝0.09x＋20.913（R2＝0.997 3），不同樣品蘆丁質(zhì)量濃度按此公式計(jì)算。

2.3 供試品溶液配制

稱取蕎麥各組織干燥樣品0.1 g包入濾紙內(nèi)，放入索氏抽提器，加入甲醇，加熱回流，直到樣品為無色，獲得提取液；再經(jīng)0.45μm濾膜過濾，精確量取提取液100μL，將提取液定容至1 mL，將此樣品按2.1色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。

2.4 精密度試驗(yàn)

選取同一濃度蘆丁對(duì)照品，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得蘆丁峰面積值的RSD為0.8%，表明儀器精密度較好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選取九江苦蕎葉組織，在24 h內(nèi)每隔2 h重復(fù)進(jìn)樣一次，記錄峰面積，供試樣品峰面積RSD為1.4%，表明樣品的穩(wěn)定性較好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

選取九江苦蕎葉組織樣品6份，每份0.1 g，按2.3方法配制供試樣品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，蘆丁峰面積RSD為1.2%，表明樣品重復(fù)性較好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

選取已知濃度的九江苦蕎葉組織樣品6份，每份0.1 g，按樣品量的80%，100%，120%加入對(duì)照品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，計(jì)算平均回收率。由表2可知，6份樣品加樣回收率平均值為99.98%，且RSD為1.38%。

表2 蘆丁加樣回收率

2.8 樣品含量測(cè)定

按2.3方法處理蕎麥各組織樣品，按2.1色譜條件分析，記錄峰面積，根據(jù)濃度計(jì)算公式、提取體積、稀釋倍數(shù)及樣品重復(fù)計(jì)算得出30個(gè)蕎麥品種的蘆丁含量（mg/g），所得結(jié)果列于表3。結(jié)果顯示，試驗(yàn)所檢測(cè)的30個(gè)蕎麥品種，花、葉、莖中蘆丁含量最高的品種分別是西農(nóng)9940、威苦01-374和KQ08-02，均為苦蕎，其含量分別為60.91，50.66，11.35 mg/g。所測(cè)試的蕎麥品種花和葉中含量相差可達(dá)10倍，表明品種間不同組織的蘆丁含量存在明顯差異（P＜0.01）。所測(cè)試的甜蕎品種花中蘆丁含量平均值為33.67 mg/g，而苦蕎品種花中蘆丁含量平均值達(dá)到50.03 mg/g。

表3 不同蕎麥品種各組織蘆丁含量測(cè)定 mg/g

續(xù)表3 mg/g

3 討論

3.1 提取方法與檢測(cè)條件

以往對(duì)于蕎麥蘆丁提取所用試劑，均采用60%～70%的乙醇或甲醇提取，而本試驗(yàn)直接采用流動(dòng)相甲醇提取，相比乙醇提取樣品的穩(wěn)定性及試驗(yàn)重復(fù)性較好。張琪等[9]在蕎麥蘆丁提取的試驗(yàn)中也得到了相同的結(jié)論。

應(yīng)用HPLC法檢測(cè)蘆丁含量，主要是控制流動(dòng)相比例及檢測(cè)波長。根據(jù)《中華人民共和國藥典》中有關(guān)蘆丁的測(cè)定，采用流動(dòng)相甲醇∶1%冰醋酸為32∶68，也有研究采用甲醇∶水（V/V）為35∶65或甲醇∶水∶乙酸（V/V/V）為45∶53∶2的配置[10-12]。本試驗(yàn)經(jīng)過反復(fù)調(diào)試，將流動(dòng)相比例設(shè)置成甲醇∶水（V/V）為46∶54，儀器運(yùn)行良好，取得了較好的試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于檢測(cè)波長，蘆丁在204，257，355 nm處有3個(gè)吸收峰，查詢《中華人民共和國藥典》中蘆丁的檢測(cè)波長為257 nm，本試驗(yàn)也采用257 nm波長進(jìn)行檢測(cè)，效果良好。

3.2 品種間蘆丁含量差異分析

從不同蕎麥品種各組織蘆丁含量測(cè)定結(jié)果可以看出，所有供試品種中花的蘆丁含量明顯高于其他組織。其中，莖中蘆丁含量相比其他組織較低，在生產(chǎn)應(yīng)用中，不適用蘆丁開發(fā)的進(jìn)一步研究。唐宇等[13]對(duì)蕎麥總黃酮含量的測(cè)定也證實(shí)，蕎麥中總黃酮含量大小依次為花＞葉＞種子＞莖。

考量30個(gè)品種各器官蘆丁含量，所測(cè)試的苦蕎品種整體高于甜蕎，僅有甜蕎品種（云引1號(hào)）花中蘆丁含量達(dá)到53.88 mg/g，高于苦蕎花中蘆丁含量的平均值，這為進(jìn)一步篩選高蘆丁含量的甜蕎品種提供了良好的參考。西農(nóng)9940花中蘆丁含量最高（60.91 mg/g），但葉中含量較低（26.52 mg/g）。綜合考察，九江苦蕎花和葉中的蘆丁含量較高，分別為53.22，47.14 mg/g。盡管所測(cè)試蕎麥品種花比其他器官蘆丁含量高，但其花器小、產(chǎn)量低、無限花序等特點(diǎn)，成為開發(fā)利用蕎麥蘆丁的限制瓶頸。本試驗(yàn)全面分析了甜蕎和苦蕎品種間各器官蘆丁含量的差異表現(xiàn)，篩選出高蘆丁含量的甜蕎和苦蕎品種，為進(jìn)一步蕎麥品種選育提供參考。并且本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，一些蕎麥品種葉片中也有較高的蘆丁含量，例如美混選、九江苦蕎、KQ080-02、黔苦4號(hào)以及黑豐1號(hào)等品種蘆丁含量均在40 mg/g以上。這為選育高蘆丁含量的品種提供了新視野，可定向選育葉片蘆丁含量較高的品種，用以解決生產(chǎn)上蘆丁來源途徑狹窄的問題，并為全面開發(fā)利用苦蕎各器官提取蘆丁提供了有價(jià)值的參考。

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