等離子體注入棗樹接穗的誘變?cè)囼?yàn)

陳紅玉，馬光躍，郝學(xué)金，申仲妹

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030006）

早在20世紀(jì)80年代，我國水稻育種工作者就已開始利用等離子體注入水稻品種，獲得了損傷輕、突變率高、突變譜廣的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，證實(shí)了其作為誘變育種的一種新的誘變?cè)词乔袑?shí)可行的、有效的[1]。等離子注入誘變主要設(shè)備是離子注入機(jī)，利用高壓加速的氣體離子轟擊目標(biāo)材料，使之產(chǎn)生突變，極大地增加了生物基因的突變幾率，縮短了作物改良時(shí)間，減少了育種的工作量[2-4]。岳潔瑜等[5]通過對(duì)胚珠DNA的SSR標(biāo)記分析，在DNA水平上檢測(cè)氮離子束誘變后胚珠的多態(tài)性變化，結(jié)果表明，離子注入陸地棉花花粉后再給雌蕊授粉，會(huì)對(duì)胚珠的DNA多態(tài)性產(chǎn)生影響，在一定程度上改變花粉中精細(xì)胞的DNA序列。馬海林等[6]研究不同劑量N+注入對(duì)菜用大豆出苗率及后代遺傳變異的影響，結(jié)果表明，誘變后代變異可能出現(xiàn)在誘變當(dāng)代，也可能出現(xiàn)第2代中，因此，進(jìn)行變異選擇時(shí)建議從第2代以后開始。徐明照等[7]用N+束注入玉米H65和H14D種子，研究其M1的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)，結(jié)果表明，離子注入不僅能夠誘發(fā)M1根尖細(xì)胞核和染色體畸變，而且還能誘發(fā)染色體出現(xiàn)多種變異類型；其畸變頻率隨離子注入劑量的增加而增大。山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自從俄羅斯引進(jìn)等離子注入設(shè)備以來，經(jīng)誘變處理已育成品黍1號(hào)[8]、品黍2號(hào)[9]、晉蕎麥（苦）4號(hào)[10]等一批農(nóng)作物新品種及新種質(zhì)材料，然而經(jīng)查新，該技術(shù)在果樹誘導(dǎo)芽變領(lǐng)域尚未見成功的報(bào)道。本試驗(yàn)通過對(duì)棗樹接穗的等離子體注入，探索棗樹誘變育種的新途徑。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試棗樹接穗為駿棗、壺瓶棗、葫蘆棗和大荔龍棗接穗；石蠟；寬度1.5 cm的防水耐高溫膠紙。供試設(shè)備為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心真空等離子體注入機(jī)，供試氣體是高純氮，處理后的接穗嫁接于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所棗苗圃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接穗準(zhǔn)備 供試接穗于2012年3月中旬采集，將健壯棗頭枝中段部分剪成單芽接穗，隨即在100～120℃的石蠟中快速浸蘸進(jìn)行保水處理，蠟封后的接穗置于冷藏柜冷藏；等離子體注入前供試接穗用防水耐高溫膠帶紙嚴(yán)密纏裹2層，僅露出被輻照的芽體部分。

1.2.2 處理劑量 將準(zhǔn)備好的接穗放入樣品盤固定，被照芽體朝上，送入離子注入機(jī)進(jìn)行處理。注入氣體為氮?dú)猓ㄓ肗+表示數(shù)量），誘變劑量設(shè)3個(gè)處理，A.4×1016個(gè)/cm2；B.6×1016個(gè)/cm2；C.8×1016個(gè)/cm2。注入速度為10 mA×30 kV，靶室真空度為4×10-4MPa，每處理24個(gè)重復(fù)。對(duì)照接穗浸蠟纏繞膠帶紙，不進(jìn)行等離子注入。樣品處理完畢后用濕毛巾包裹放入冷藏柜冷藏，待5月初將處理后的接穗纏裹物去除，用切接法嫁接，當(dāng)日嫁接完畢，掛牌標(biāo)記以備調(diào)查。

1.2.3 調(diào)查內(nèi)容及方法 （1）萌動(dòng)率。嫁接后每2 d觀察各處理萌動(dòng)情況，統(tǒng)計(jì)萌動(dòng)數(shù)，萌動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)為主芽露出綠尖即確定為萌動(dòng)。（2）生長情況。接穗萌動(dòng)后每5 d測(cè)量一次所有新梢生長長度，待新梢停止生長后，計(jì)算每處理株的生長期。（3）變異情況。包括葉片大小、枝條分布等綜合狀況。對(duì)有明顯變異的單株進(jìn)行拍照及取樣比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)各品種棗樹接穗萌動(dòng)率及萌動(dòng)時(shí)期的影響

表1 不同處理對(duì)各品種萌動(dòng)率的影響 %

從萌動(dòng)率來看，各品種對(duì)照的萌動(dòng)率均高于其他處理，其中，壺瓶棗和大荔龍棗對(duì)照萌動(dòng)率顯著高于處理B、處理C，駿棗和葫蘆棗對(duì)照萌動(dòng)率顯著高于其他3個(gè)處理（表1）。說明離子注入過程中可殺死部分接穗芽體，致使其無法萌動(dòng)。

從萌動(dòng)期早晚及集中度來看（圖1），各品種對(duì)照接穗萌動(dòng)普遍早于誘變處理，而且CK＞A＞B＞C。對(duì)照萌動(dòng)的集中度最高，曲線有明顯的峰值，其次為處理A、處理B，處理C峰值最不明顯。說明離子注入過程中，隨著注入強(qiáng)度的增加，對(duì)芽體造成的損傷在加大，接穗芽體自愈需要時(shí)間越長，芽體恢復(fù)萌動(dòng)能力的時(shí)間越長。

2.2 不同處理對(duì)各品種棗頭枝生長的影響

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，各品種新梢在8月26日已全部停止生長，比較各品種不同處理新生棗頭長度，發(fā)現(xiàn)除駿棗處理A、處理C間存在顯著差異外，其他品種各處理間差異均不顯著。說明盡管離子注入對(duì)芽體產(chǎn)生了生理損傷，使芽體萌動(dòng)受到影響，但對(duì)芽體萌動(dòng)后的生長并未產(chǎn)生明顯影響（表2）。

表2 不同處理對(duì)各品種棗頭枝生長量的影響 cm

2.3 不同處理對(duì)各品種棗樹生長期的影響

新梢生長期是棗樹的主要生物學(xué)指標(biāo)，與果實(shí)成熟期有重要關(guān)系。本試驗(yàn)表明，棗頭枝最早停止生長在7月10日，最晚在8月26日，相差46 d。為分析離子注入對(duì)棗頭枝生長期的影響，統(tǒng)計(jì)了各品種棗頭枝生長期長短，結(jié)果顯示，壺瓶棗C處理?xiàng)楊^枝生長量與對(duì)照間存在顯著差異，且平均生長天數(shù)處理C＞CK；駿棗平均生長天數(shù)處理A與處理B，C間存在顯著差異，且處理A＞B＞C；葫蘆棗、大荔龍棗各處理間差異不顯著。說明N+注入對(duì)棗頭枝生長期有影響，但不同品種對(duì)不同劑量的響應(yīng)存在差異（表3）。

表3 不同處理對(duì)各品種棗頭枝生長天數(shù)的影響 d

2.4 不同處理對(duì)棗樹變異的影響

試驗(yàn)中所有棗樹只有2株有果，尚看不出離子注入對(duì)果實(shí)變異的影響，但在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，壺瓶棗處理C有2株葉片明顯大于壺瓶棗其他處理，排除水肥條件、邊際效應(yīng)可能引起的飾變，這2株壺瓶棗苗確實(shí)為離子注入產(chǎn)生的變異。表4為其中一變異株葉片與對(duì)照葉片的比較，可以明顯看出，對(duì)照葉片的面積明顯小于變異株，且二者間差異顯著。

表4 壺瓶棗變異株葉片與對(duì)照葉片的比較

3 討論

3.1 等離子注入棗接穗的處理方法

等離子注入環(huán)境為低壓高溫環(huán)境，適宜劑量處理含水量低的作物種子不會(huì)全部殺死種子；而棗接穗含水量高，曾嘗試對(duì)浸蠟保水后的棗接穗進(jìn)行小劑量注入處理，結(jié)果接穗全部失水死亡，為此，本試驗(yàn)用雙層防水耐高溫膠帶紙嚴(yán)密纏裹接穗，只露出被輻照的芽體部分，并以芽體為靶進(jìn)行集中注入，取得了成功。我們還對(duì)蘋果、葡萄接穗采用此法進(jìn)行等離子注入，同樣取得了成功，為果樹接穗誘變處理探索出一種新的方法。

3.2 不同品種對(duì)誘變劑量的響應(yīng)

呂杰等[11]研究表明，N+注入劑量之間與2個(gè)苜蓿品種之間存在差異，不同劑量的影響要比2個(gè)不同品種影響大。離子束誘變育種及品質(zhì)改良中，應(yīng)針對(duì)不同品種、不同處理目的靈活設(shè)計(jì)合適的劑量范圍與梯度，并采取不同處理方式。那日等[12]研究N+注入對(duì)紫花苜蓿幼苗生長和營養(yǎng)成分的影響表明，注入劑量為2.08×1016～8.32×1016個(gè)/cm2時(shí)，發(fā)芽率隨注入劑量加大，種子發(fā)芽率存在增加、平緩、下降直至降為零的過程。以上研究結(jié)果顯示，不同物種種子發(fā)芽率或出苗率對(duì)誘變劑量的響應(yīng)不盡相同，但多數(shù)物種在合適劑量處理下可以提高種子發(fā)芽率或出苗率。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同品種的萌芽率對(duì)誘變劑量的響應(yīng)不盡相同。在各品種棗頭枝生長量的比較中，除駿棗處理A和處理C棗頭枝生長量間存在顯著差異外，其他品種各處理間均不存在顯著差異。在棗頭枝生長期的比較中，壺瓶棗處理C與CK間存在顯著差異，駿棗處理A與處理B，C間有顯著差異，而葫蘆棗及大荔龍棗各處理間差異不顯著，說明葫蘆棗和大荔龍棗對(duì)本試驗(yàn)所設(shè)誘變劑量響應(yīng)不明顯。初步分析以為，試驗(yàn)中所設(shè)誘變劑量處理較少，注入強(qiáng)度較輕，且未達(dá)到致死劑量，有必要在今后的試驗(yàn)中在更大劑量范圍內(nèi)優(yōu)化注入?yún)?shù)，以進(jìn)一步提高突變率。

3.3 不同誘變劑量對(duì)棗樹變異的影響

在誘變調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，壺瓶棗處理C中有2株突變，其中1株主要表現(xiàn)為葉片明顯變大，另1株沒有棗頭，只有3個(gè)棗吊，1個(gè)棗吊直立生長，長度達(dá)58 cm，葉片也明顯增大。也有駿棗個(gè)別株生長極慢或過早停止生長的現(xiàn)象，是否為變異，尚無法判斷。本研究所處理苗木2013年才可以結(jié)果，有關(guān)果實(shí)等經(jīng)濟(jì)學(xué)及其他生物學(xué)性狀變異需要進(jìn)一步觀測(cè)。

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