針刺對兔膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨TGF－β1、TNFα的影響作用＊

繆輝宇 萬 雷 陳 宇 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院（廣州510240）

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）是一種慢性關(guān)節(jié)疾患，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨退化以及損害后關(guān)節(jié)內(nèi)骨的增生、變形導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能改變甚至功能喪失。我國患膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的人數(shù)占總?cè)丝诩s3%，其中55歲以上人群在X線上有膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)者約占6%，65歲以上老年人膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率高達(dá)85%［1，2］。目前該病的治療尚未取得突破性進(jìn)展，防治OA 已成為當(dāng)今國際上的研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)有西醫(yī)治療多以非甾體類抗炎藥緩解癥狀為主，但長期使用后胃腸道毒副作用明顯，常使患者不能耐受而終止治療。相對而言，針刺療法具有簡便價(jià)廉且適合長期使用的特點(diǎn)，故越來越引起了醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。針刺療法在治療OA方面的確切療效已被臨床實(shí)踐所驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致OA 關(guān)節(jié)破壞的主要原因是軟骨合成和分解代謝的失衡［3，4］，這種失衡很大程度在于病變關(guān)節(jié)部位細(xì)胞因子的異?；顒?dòng)，其中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF－β1）和腫瘤壞死因子（TNFα）參與軟骨細(xì)胞的生長、分化，和軟骨代謝關(guān)系最為密切。為了探索針刺防治OA 的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制，本課題引入TGF－β1、TNFα細(xì)胞因子，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)研究針刺對TGFβ1、TNFα的影響，探討針刺防治OA的作用機(jī)理。

1 材料與方法 1.1 動(dòng)物 新西蘭大白兔30只，體重2.5～3.0Kg，雄性，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有大白兔均飼養(yǎng)于恒溫恒濕的清潔環(huán)境中，環(huán)境溫度為（25±1）℃，濕度70%，每天12h光照／黑暗，任意進(jìn)食飼養(yǎng)者提供的大白兔標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來水。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 分組與造模 將新西蘭大白兔30只隨機(jī)分為2組，即造模組27只，正常組3只。正常組不予任何處理，造模組用戊巴比妥鈉（30mg／kg）靜脈注射麻醉，消毒膝關(guān)節(jié)皮膚，將4%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.3mL通過髕上韌帶兩側(cè)注入兔膝關(guān)節(jié)腔，每3d1次，連續(xù)注射3次。術(shù)后持續(xù)1周肌注青霉素20萬U／d以預(yù)防感染。動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)，木瓜蛋白酶末次注入后第2天，以空氣栓塞法處死C組動(dòng)物，解剖左膝關(guān)節(jié)，于脛骨平臺處切取關(guān)節(jié)軟骨組織，觀察關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)變化，評估造模是否成功。

2.2 干預(yù)方法 造模成功后再隨機(jī)分3組，即模型組，針刺組，西樂葆組，每組8只。模型組不作任何處理，針刺組行針刺治療，西樂葆組予西樂葆灌胃給藥。

西樂葆組動(dòng)物按24mg／d／只灌服西樂葆，每天1次，連續(xù)灌胃36d。

針刺組：取穴“內(nèi)外膝眼”、“鶴頂”、“梁丘”、“血?！?、“足三里”，備皮，穴位局部常規(guī)消毒，以毫針進(jìn)行針刺，行提插捻轉(zhuǎn)、平補(bǔ)平瀉手法。留針20min，每隔5min捻針1次。每天1次，10次為1個(gè)療程，療程間休息3d，再行下1個(gè)療程，共針刺3個(gè)療程。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死全部新西蘭兔，取左膝股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)液進(jìn)行觀察和檢測。

2.3 指標(biāo)檢測 2.3.1 關(guān)節(jié)軟骨組織的形態(tài)學(xué)觀察 取股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨，用10%中性多聚甲醛溶液固定24h后，EDTA脫鈣4～8w。HE染色：脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，展片，染色。觀察軟骨層的完整性、軟骨細(xì)胞的分布及數(shù)量、潮線及軟骨下骨的改變。進(jìn)行Mankin評分（1～5分為早期，6～9分中期，10～14分為晚期）［5］，驗(yàn)證造模成功。

2.3.2 關(guān)節(jié)液的抽取檢測 關(guān)節(jié)液的抽?。和孟ゲ棵薷蓛簦?.5mL一次性無菌注射進(jìn)行膝關(guān)節(jié)穿刺，注入無菌生理鹽水1mL，反復(fù)抽吸、注入3～5次，使沖洗液混勻，最后盡量抽盡膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)液體。將抽取的關(guān)節(jié)液3000r／min 離心20min，收集上清液，最后得關(guān)節(jié)液0.5mL／膝，置于－20℃低溫冰箱保待檢采用ELISA法檢測關(guān)節(jié)液中TGF－β1和TNF－α的水平，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用（±s）表示，采用方差分析，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果 3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 實(shí)驗(yàn)共納入30只白兔，其中6只用于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型驗(yàn)證，最后24只進(jìn)入結(jié)果分析，無脫落，見表1。

3.2 各組關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)Mankin′s評分 Mankin′s評分結(jié)果顯示，模型組Mankin′s評分較正常組明顯升高（P＜0.01），說明造模成功。針刺組和西樂葆組Mankin′s評分均較模型組低（P＜0.01），但兩組間差異無顯著性意義（P＞0.05），見表2。

表1 兩組關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)Mankin′s評分結(jié)果

表2 造模后三組關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)Mankin′s評分結(jié)果

3.3 三組兔膝關(guān)節(jié)液中TGF－β1和TNF－α的水平比較 見表3 兔膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生后，關(guān)節(jié)液中TNF－α的水平明顯增高（P＜0.01），TGF－β1水平明顯降低。針刺和西樂葆治療后關(guān)節(jié)液中TNF－α水平較模型組顯著降低（P＜0.01），兩組間比較差異無顯著性意義（P＞0.05）；而TGF－β1水平較模型組明顯升高（P＜0.01），且兩組間比較差異有顯著性意義（P＜0.01）。

表3 三組兔膝關(guān)節(jié)液中TGF－β1和TNF－α的水平比較

4 討 論 膝骨關(guān)節(jié)炎是一種多發(fā)于中老年人的慢性退行性疾病，其主要病理特征是膝關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞數(shù)目的減少和軟骨基質(zhì)的降解。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞因子在OA中的作用越來越受到人們的關(guān)注。細(xì)胞生長因子是一組具有促進(jìn)細(xì)胞生長增殖和合成的蛋白質(zhì)或多肽對骨和軟骨的形成與修復(fù)起局部調(diào)節(jié)作用。其中TGF－β1表現(xiàn)出多重生物學(xué)特性，是各種生長因子中促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖最有效的生長因子，對修復(fù)軟骨損傷具有重要作用。在牛軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)中，TGF－β1加快了蛋白多糖的代謝，并刺激膠原和葡糖胺聚糖在兔關(guān)節(jié)軟骨中的合成，降低細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解［5］。Aral等［6］用腺病毒介導(dǎo)將TGF－β1基因成功地轉(zhuǎn)入人軟骨樣細(xì)胞株HCS－2／8，顯著增加了軟骨特異性Ⅱ型膠原和蛋白多糖核心蛋白的表達(dá)，并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶23表達(dá)，說明TGF－β1可刺激軟骨細(xì)胞增生，促進(jìn)糖蛋白轉(zhuǎn)化，增加軟骨基質(zhì)的合成，拮抗炎癥因子，從而有利于軟骨修復(fù)。有實(shí)驗(yàn)顯示，TGF－β1不足可能是OA 的致病的重要因素之一［7］。不過，也有資料表明TGF－β1對軟骨細(xì)胞可能具有雙向調(diào)節(jié)作用［8］，一方面，它能促進(jìn)未分化的和分化早期的軟骨細(xì)胞DNA復(fù)制，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖并促進(jìn)蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成；另一方面，對分化末期的軟骨細(xì)胞，TGF－β1則抑制其分化并抑制軟骨基質(zhì)的合成和鈣化。

TNF－α是一種多功能炎性細(xì)胞因子，主要參與激活多型核細(xì)胞，刺激滑膜細(xì)胞的前列腺素E2（prostglandins E2，PGE2）的產(chǎn)生，增加骨和軟骨的破壞，刺激人軟骨細(xì)胞分泌纖維蛋白溶酶激活劑，使纖維蛋白溶酶原變成纖維蛋白溶酶而加重關(guān)節(jié)炎損傷，同時(shí)，破骨細(xì)胞減少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并產(chǎn)生膠原酶和其他中性蛋白酶，釋放骨鈣等，從而導(dǎo)致骨和軟骨的破壞。大量研究結(jié)果表明，TNF－α能促進(jìn)成纖維細(xì)胞釋放黏附分子，激活并增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞對黏附分子的表達(dá)，使血液中的白細(xì)胞通過與黏附分子相互作用被集中到關(guān)節(jié)腔參與對軟骨細(xì)胞的破壞，對于TNF－α水平增高的具體原因，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為可能主要與滑膜的炎性變有關(guān)［5］。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，造模成功后，模型組Mankin′s評分、TNFα水平明顯升高（P＜0.01），而TGF－β1明顯降低（P＜0.01），說明造模成功，造模后膝關(guān)節(jié)軟骨開始退化，關(guān)節(jié)腔內(nèi)促炎性細(xì)胞因子TNF－α和抗炎性細(xì)胞因子TGF－β1分泌增多。針刺和西樂葆雖然對各炎性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)略有所差異，但總的看來，起調(diào)節(jié)趨勢是一致的，均可降低TNF－α和升高TGF－β1。骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹癥”范疇，多以肝腎不足為本，氣滯血瘀為標(biāo)，臨床治療應(yīng)從中醫(yī)角度辨證，以補(bǔ)肝腎為總治則，施以辨證論治。針刺療法是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)治療方法，具有簡便價(jià)廉且適合長期使用的特點(diǎn)，針刺療法在治療OA方面的確切療效已被臨床實(shí)踐所驗(yàn)證。本研究結(jié)果再次表明，針刺特定穴位可以減少關(guān)節(jié)液中TNF－α水平，改變關(guān)節(jié)局部的內(nèi)環(huán)境，對早期兔膝OA起防治作用。值得注意的是，針刺組TGF－β1水平較西樂葆組明顯升高（P＜0.01），提示針刺不僅可降低受損關(guān)節(jié)局部炎癥，更可以促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞生長因子的分泌，從而加速受損軟骨修復(fù)，顯示針刺具有良好的雙向調(diào)節(jié)作用。總之，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示早期采用針刺特定穴位，能降低關(guān)節(jié)液TNF－α水平和升高TGF－β1水平，減輕關(guān)節(jié)軟骨退行性變。因此，調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞因子是針刺防治早期兔膝OA的作用機(jī)制之一。

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