通便玉蓉丸的長期毒性實驗＊

周永學 吳永豐 王 斌 陜西中醫(yī)學院（咸陽712046）

便秘是消化道疾病中最常見的病證之一，全世界大約有5%～25%的人口受到本病的困擾。其中60歲以上的老年人約占18%～23%，如果僅把排便困難作為本病的主訴來評定，發(fā)病率將超過50%［1～3］，隨著我國人口老齡化加劇，老年便秘人群比重正在不斷加大。通便玉蓉丸由肉蓯蓉、當歸、芒硝、黃芩組成，具有溫腎益精，潤腸通便的功效，臨床可用于治療腎虛之習慣性便秘，尤其是老年腎虛便秘。其組方不含蒽醌類藥物，避免了蒽醌成分的毒副作用［4］。

本實驗旨在通過觀察連續(xù)重復給大鼠灌服通便玉蓉丸浸膏粉3、6個月所產生的毒性反應的癥狀、嚴重程度、靶器官及其恢復、發(fā)展情況，評價藥物的長期毒性反應，為臨床研究提供參考依據(jù)。

1 實驗材料 1.1 動物 SD大鼠180只，清潔級，體重60g～90g，雌雄各半，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（軍）2007－007。

1.2 藥品 通便玉蓉丸由陜西中醫(yī)學院藥物研究所提供，批號100101。為黑褐色干燥粉末，每g浸膏粉相當于生藥1.997g，與臨床用通便玉蓉丸同；實驗前用蒸餾水配成70%、35%（g浸膏粉／100mL）通便玉蓉丸浸膏粉混懸液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?，用時置于水浴鍋36℃～39℃加熱攪勻。

1.3 儀器及試劑 全自動生物組織脫水機，TP1020型，德國；生物組織包埋機，EG1150型，德國；生物組織切片機，HM315型，德國；光學顯微鏡，DmLS2型，德國；生物組織烘片機，HI1220型，德國；生物組織攤片機，TP－1型，天津航利達；病理圖文處理系統(tǒng)，BI－2000，四川成都；電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；MINDRAY 血常規(guī)自動分析儀，RA7C－3368，邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；生化自動分析儀，BS－300，北京普利生儀器有限公司；高性能血凝儀，C2000－A，北京普利生儀器有限公司；CORNLEY 電解質分析儀，CAFT－500；網織紅細胞染色液，J115，溫州市康泰生物科技有限公司；瑞姬氏復合染液，JK10，溫州市康泰生物科技有限公司。

2 實驗方法［5～6］2.1 分組及給藥 SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周，按體重隨機分為高劑量組（42g／kg·d－1）、中劑量組（21g／kg·d－1）、低劑量組（10.5g／kg·d－1）和對照組，每組45只，受試藥物按60kg成人每日服用30g等效換算，分別等效于成人量的42、21、10.5倍，給藥體積均為1.5mL／100g，對照組給予等體積蒸餾水，連續(xù)給藥6個月，每周給藥6d。

2.2 檢測方法 每天進行一般觀察，每周記錄一次體重，攝食攝水量。給藥3個月和6個月，每次每組1／3大鼠麻醉（10%水合氯醛），頸動脈取血檢測血液學、血液生化學、主要臟器濕重并計算臟器系數(shù)，鏡檢臟器及組織病理變化。其余SD大鼠停藥，常規(guī)飼養(yǎng)4周后處死，檢測內容及方法同前。

2.3 檢測內容 2.3.1 一般情況觀察 觀察動物外觀體征、行為活動、呼吸、腺體分泌、糞便性狀，攝食量、攝水量、體重以及死亡情況和中毒反應。

2.3.2 對大鼠體重、攝食量和攝水量的影響 每周稱取一次體重并測取攝食量、攝水量各一次，記錄后統(tǒng)計。

2.3.3 血液學的檢測項目［7］包括白細胞數(shù)（WBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞數(shù)（RBC）、紅細胞比容（HCT）、紅細胞平均容積（MCV）、紅細胞平均血紅蛋白（MCH）、紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細胞分布寬度變異系數(shù)（RDW－CV）、紅細胞體積分布寬度標準差（RDW－SD）、血小板計數(shù)（PLT）、血小板分布寬度（PDW）、血小板積壓（PCT）、以及平均血小板體積（MPV）；活化部分凝血酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）；推片計數(shù)網織紅細胞（RC）和白細胞分類。

2.3.4 血液生化學的檢測項目 血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、谷草／谷丙（AST／ALT）、堿性磷酸酶ALP總膽紅素TBIL總蛋白TP白蛋白ALB球蛋白（GLB）、白蛋白／球蛋白（ALB／GLB）、總膽固醇（T－CHO）、甘油三酯（TG）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血糖（GLU）、鉀離子（K＋）、鈉離子（Na＋）、氯離子（Cl－）、鈣離子（Ca2＋）。

2.3.5 計算臟器系數(shù) 精密稱量肝、心、脾、肺、腎、腦、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢、睪丸、附睪，計算臟器系數(shù)（臟器系數(shù)＝臟器重量g／體重g×100）。

2.4 病理組織學檢查 肝、心、脾、肺、腎、胸腺、甲狀腺、頜下腺、腎上腺、食管、氣管、胰腺、胃、小腸、大腸、腸系膜淋巴結、脊髓（頸、胸、腰）、膀胱、卵巢、子宮、陰道、腦（大腦、小腦、腦干）、垂體、睪丸、附睪、前列腺、坐骨神經、胸骨（骨、骨髓）、主動脈等。將上述臟器和組織取材修剪后放入10%福爾馬林液中固定，常規(guī)取材、脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色，光鏡下進行病理學檢查。

3 結 果 3.1 對一般情況的影響 給藥7d后高劑量組SD大鼠部分有肛門不潔現(xiàn)象，中、低劑量組較少。給藥4周后，黑稀藥便有所減少，多呈尚能成形的黑潤便，給藥組肛門多有不潔，以高劑量組為??；各給藥組的鼠盒內大便數(shù)量明顯較對照組多。停藥后，大便恢復正常。除此之外在實驗過程中各組大鼠行為、自主活動、攝水、攝食以及尿液等均未見異常，口、眼、耳、鼻未見異常分泌物。

3.2 對大鼠體重的影響 高劑量組雄性大鼠1周、2周、3周、5周、19周、26周與對照組比較差異有顯著性意義（P＜0.05或P＜0.01），高劑量組雄性大鼠體重均數(shù)普遍低于對照組，在恢復期（27－30周）高劑量組雄性大鼠體重均數(shù)高于對照組；高劑量組雌性大鼠體重1周、2周與對照組比較差異有顯著意義（P＜0.05或P＜0.01）；之后無差異。結果見表1。

表1 通便玉蓉丸給藥對大鼠體重的影響（g，±s）

表1 通便玉蓉丸給藥對大鼠體重的影響（g，±s）

注：各給藥組與對照組比較△P＜0.05 ▲P＜0.01；下表同。

性別 時間對照組低劑量組中劑量組高劑量組雄性 0周111.59±10.66 112.14±10.49 114.17±10.63 114.87±9.02 1周171.82±14.27 174.82±11.93▲173.48±12.76▲159.74±14.62▲2周234.55±16.23 236.86±11.37▲236.61±14.29▲220.00±12.12▲3周298.32±19.77 301.73±13.93▲293.13±18.55△280.32±13.91▲4周338.91±22.51 357.86±27.15▲345.73±25.44△327.55±22.17 5周387.64±28.39 391.41±25.96△386.86±25.58 369.82±27.48△6周378.50±28.26 402.95±31.22▲△394.09±28.27 380.24±29.18 19周584.33±40.45 578.13±65.89 575.07±54.57 546.29±55.04△26周623.93±60.58 623.20±71.71 615.43±53.69 572.62±66.45△27周595.14±35.68 631.71±72.84 634.14±26.66△621.83±62.77 28周593.86±36.10 632.71±69.39 653.57±33.71▲624.50±60.02 29周600.29±40.02 646.57±75.41 658.00±42.15△636.67±74.24 30周609.14±54.38 665.57±79.78 652.43±54.52 649.83±89.69雌性 0周112.74±9.57 112.96±8.81 111.86±7.83 113.05±8.30 1周160.09±11.16 160.26±9.72△154.77±9.72 151.32±13.93△2周195.26±13.34 193.78±11.63▲191.14±11.32△182.09±16.82▲3周216.30±14.38 216.17±14.07 215.64±12.57 212.50±11.39 6周247.04±17.47 254.57±17.10 255.55±18.13 253.59±17.76 9周279.39±20.76 286.09±17.06 278.90±19.90 286.82±18.78 12周295.26±26.00 302.70±21.03 297.05±26.03 302.55±21.12 16周315.00±23.78 308.53±24.11 311.14±16.90 316.73±23.36

3.3 對大鼠攝食量的影響 在通便玉蓉丸長期毒性實驗初期各組攝食量增長明顯，在中后期在一定水平基本呈S型變化；其中大劑量組攝食量線平均水平低于其它三線，說明大劑量組攝食量略低于其它組別，但差別不明顯，在后期基本一致。見圖1。

3.4 對大鼠攝水量的影響 在通便玉蓉丸長期毒性實驗初期各組大鼠攝水量均呈增長趨勢，中后期在一定水平呈不規(guī)則S形分布，在不同時期，各攝水量線基本一致。見圖2。

圖1 通便玉蓉丸長期毒性實驗對各組大鼠攝食量的影響

圖2 通便玉蓉丸長期毒性實驗對各組大鼠攝水量的影響

3.5 通便玉蓉丸對大鼠血液學指標的影響 給藥3、6個月后血液學與對照組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或P＜0.01）指標中，高劑量組在3個月給藥結束后TT呈劑量－效關系，但6個月給藥結束后未見差異，不能說明是持續(xù)灌服通便玉蓉丸造成的。其余PLT、PCT、HCT、MCHC均未見量－效關系和時－效關系，停藥4周后血液學指標在各組之間均未見統(tǒng)計學差異，說明通便玉蓉丸對大鼠血液學指標的影響具有可逆性且無延遲反應。結果見表2。

表2 通便玉蓉丸對血液學指標的影響（±s）

表2 通便玉蓉丸對血液學指標的影響（±s）

時間項目對照組低劑量組中劑量組高劑量組3個月PLT（109／L）848.50±123.59 753.67±108.55△779.27±192.11 749.07±129.56△PCT（ug／L）0.65±0.04 0.61±0.08 0.60±0.05△0.57±0.06▲PT（S）18.61±4.25 16.26±2.01 17.96±1.76 19.12±3.06 TT（S）33.75±5.15 31.88±3.07 31.76±4.1 29.00±2.33▲6個月HCT（%）40.69±3.74 41.02±2.51 40.04±5.01 37.45±4.82△MCHC（g／L）350.40±12.72 349.87±9.80 356.93±16.93 365.67±15.96▲RDW－CV（%）13.96±0.75 13.69±0.77 14.25±1.15 14.27±0.99 RDW－SD（%）21.85±1.10 21.52±0.47 22.11±1.06 21.75±1.12 PLT（109／L）712.27±107.82 750.67±91.99 757.60±100.59 724.07±151.81 PT（S）16.50±2.05 16.84±2.05 17.67±3.28 16.80±2.71 TT（S）27.75±3.47 28.25±1.41 29.48±2.68 27.44±5.0 2

3.6 通便玉蓉丸對大鼠血液生化學指標的影響 給藥3、6個月后血液生化學與對照組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或P＜0.01）的指標中，TG在高劑量組給藥3個月結束后降低并呈現(xiàn)量－效關系，并且在6個月給藥結束后中、高劑量組也有統(tǒng)計學差異性降低，故推測通便玉蓉丸對高劑量組TG有降低作用，臨床意義重大；6個月給藥結束后高劑量組GLB增高并呈現(xiàn)劑量－效應關系，應與高劑量組1d灌胃兩次而使食管損害大于其它給藥組引起相關的炎癥和感染有關；其余與對照組比較具有統(tǒng)計學差異的指標均未呈現(xiàn)量－效關系，而低劑量組在給藥6個月后AST、ALT、Cr均明顯低于對照組，說明通便玉蓉丸在該劑量下有保護肝腎的作用；停藥4周后血液生化學指標在各組之間均未見統(tǒng)計學差異，說明通便玉蓉丸對大鼠血液生化學指標的影響具有可逆性且無延遲反應。結果見表3。

表3 通便玉蓉丸給藥對血液生化學指標的影響±s

表3 通便玉蓉丸給藥對血液生化學指標的影響±s

時間項目對照組低劑量組中劑量組高劑量組3個月ALT（u／L）54.14±13.24 52.60±15.24 47.20±14.07 53.93±11.85 AST（u／L）170.21±48.68 188.20±46.33 177.67±66.15 173.64±33.28 TG（mmol／L）1.13±0.47 0.95±0.32 0.87±0.27 0.77±0.28△Cr（μmol／L）77.13±12.66 80.08±12.49 76.89±12.06 75.44±10.22 6個月GLB（g／L）27.80±2.37 28.80±2.01 29.00±3.16 30.27±2.69△ALB／GLB 1.31±0.07 1.28±0.07 1.25±0.08 1.23±0.09△ALT（u／L）40.67±12.25 32.60±7.26△40.40±15.87 38.73±13.84 AST（u／L）131.33±40.96 96.60±22.76▲125.13±54.57 124.27±41.77 TG（mmol／L）1.21±0.39 1.20±0.31 0.81±0.24▲0.84±0.24▲Cr（μmol／L）81.07±6.94 70.40±7.85▲73.86±7.37△77.66±8.94

3.7 通便玉蓉丸對大鼠臟器系數(shù)的影響 6個月給藥結束后中、高劑量組的肝、腎臟器系數(shù)和高劑量組脾臟器系數(shù)與對照組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或P＜0.01），并呈現(xiàn)劑量－效應關系，分析與通便玉蓉丸對高劑量組雄性大鼠體重的抑制作用有關，當體重隨著藥物劑量增加而減小且各組臟器濕重無差異時，臟器系數(shù)會出現(xiàn)增大的假象（結合病理組織學檢查無病理變化的結果）。停藥4周后各組大鼠臟器系數(shù)均無異常。結果見表4。

表4 通便玉蓉丸給藥6個月對大鼠臟器系數(shù)的影響（±s）

表4 通便玉蓉丸給藥6個月對大鼠臟器系數(shù)的影響（±s）

臟器對照組低劑量組中劑量組高劑量組肝2.339±0.177 2.465±0.207 2.595±0.347△2.872±0.362▲0.166±0.024 0.170±0.031 0.186±0.042 0.201±0.058△腎0.578±0.087 0.616±0.082 0.660±0.100△0.682±0.090脾▲

3.8 病理組織學檢查 各時期高劑量組與對照組中有1／15只或2／15只大鼠的肺皆有肺泡間隔增厚、肺泡有局灶性炎細胞浸潤和小腸絨毛有局灶性變性，其余主要臟器及組織系統(tǒng)尸解和病理組織學檢查，未見明顯異常病理改變。

4 討 論 通便玉蓉丸各劑量組長期灌胃后，大鼠未出現(xiàn)生命體征及血液學、血液生化學指標的明顯改變，對大鼠的主要臟器濕重及臟器系數(shù)無明顯變化，主要臟器和組織無病理改變；其通過停藥4周的觀察和各項指標的檢測，得出通便玉蓉丸對大鼠各指標的影響具有可逆性且無延遲反應。病理報告分析各時期高劑量組與對照組中有1／15只或2／15只大鼠的肺和小腸有相同的病理改變，分別為成年大鼠自發(fā)性癥狀和固定不及時而出現(xiàn)自溶現(xiàn)象有關，兩者皆非藥物特異性毒性反應。其余主要臟器及組織系統(tǒng)尸解和病理組織學檢查，未見明顯異常病理改變。即通便玉蓉丸6個月病理學檢查，未發(fā)現(xiàn)明顯毒性靶器官。

以上結果提示，通便玉蓉丸在42g／kg·d－1高劑量（等效于臨床成人量的42倍）下無毒副作用，實驗大鼠連續(xù)服用6個月安全，停藥4周各指標具有可逆性且無延遲反應，可以為臨床實驗提供參考依據(jù)。

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