5'-腺苷磷酰硫酸激酶及其R68K 突變體對5'-腺苷一磷酸3'羥基的磷酸化

楊 洋，黃園波，馬建輝，孫梅好

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

硫作為構(gòu)成生命體的大量元素之一，是生命活動的必需元素，其主要存在于氨基酸、氨基酸代謝物及各種磺酸類化合物中[1-2]，參與細胞的代謝及調(diào)控。硫酸根離子是細胞的基本硫元素來源，化學性質(zhì)非常穩(wěn)定，其通過膜轉(zhuǎn)運蛋白進入細胞后，在ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase，ATPS）的催化下接受ATP的腺苷一磷酸基團形成腺苷-5'-磷酰硫酸（adenosine 5'-phosphosulfate，APS，圖1-A）。APS中的磷硫鍵具有非常高的化學能，ATPS催化的APS合成反應(yīng)非常不容易進行，反應(yīng)平衡常數(shù)大約為10-8～10-7[1，3]。在大腸桿菌中，ATPS和GTP水解酶（GTPase）組成異源二聚體形成的硫活化酶復合體（Sulfate Activating Complex，SAC）促進硫的活化。此SAC通過蛋白構(gòu)象變化偶聯(lián)ATPS和GTPase催化的2個反應(yīng)即APS的合成和GTP的水解，提高APS合成速度116倍[1，4]。APS的3'羥基可被APS激酶（APSkinase，APSK）磷酸化形成3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate，PAPS）[5-6]，PAPS可在PAPS還原酶等酶的催化下還原，最后整合到半胱氨酸及其他還原性硫化合物中[1，7-8]，也可作為硫酸轉(zhuǎn)移酶（sulfotranferase，ST）的底物進行化合物的硫酸化，參與化合物的生理功能調(diào)節(jié)及蛋白之間的互作[1，9-10]。3'，5'二磷酸核苷酸酶（3，5-bisphosphatenucleotidase，ND）[11-14]可催化3'，5'二磷酸腺苷（3'-phosphoadenosine 5'-phosphate，PAP）3'-磷酸基團的水解產(chǎn)生AMP，其KmPAP為0.7～17μmol/L[14-16]。AMP可在肌激酶（myokinase，MK）以及丙酮酸激酶（pyruvatekinase，PK）的作用下磷酸化完成ATP的再生。

研究表明，ND活性降低引起的胞內(nèi)PAP累積[12-15，17]可通過影響ST活性[18-19]、酰基載體蛋白合酶[20]和RNA加工酶[17，21]等的活性，影響細胞的生長發(fā)育。ND除水解PAP外，也水解PAPS的3'磷酸基團生成APS和無機磷酸[13，15，22-24]。

APS激酶催化APS磷酸化形成PAPS，是E.coli 硫代謝的必需酶。較APS少一個硫酸根離子（圖1-B）的AMP是否可作為APS類似物被APSK磷酸化其3'羥基，生物體內(nèi)是否存在AMP 3'羥基激酶（AMP 3'-hydxroxyl kinase，AMP3K），尚沒有相關(guān)報道。本研究主要利用APSK及其突變體，分析了其活性。

1 材料和方法

1.1 菌株與載體

菌株Escherichia coli DH5α 及BL21（DE3），pSKB4（由pGEX-6P-1改造的雙標簽表達載體，其融合蛋白標簽GST的N端具有6 Histines）由浙江省重中之重現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物防治技術(shù)與作物病害防控實驗室保存。pMD18-T簡易載體購自TaKaRa公司。

1.2 酶與生化試劑

兔肌肉丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、兔肌肉乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）購自羅氏公司；還原型輔酶I（NADH）、還原型谷胱甘肽（GSH）購自Sigma公司；鎳柱親和層析樹脂（Ni-NTA） 購自Novagen公司，PreScission蛋白酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）親和層析樹脂為GEHealthcare產(chǎn)品；溶菌酶（lysozyme）、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG）、抑肽素（Pepstatin A）購自Amresco公司；磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）、三磷酸腺苷（ATP）、苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）為BBI產(chǎn)品；QuikChangeRXL Site-Directed Mutagenesis Kit購自Stratagene公司；超濾管購自Millipore公司；pfu Taq DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶分別購自Takara和New England Biolabs。腺苷5'-磷酰硫酸按照發(fā)表的方法[25]合成。其他為購自國內(nèi)公司分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 大腸桿菌APSK基因克隆、突變及蛋白表達、純化 以E. coli DH5α 基因組為模板及PCR引物（APSKF和APSKR，表1）擴增APSK基因。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳割膠回收、純化及雙酶切（Nde I/Xho I）后連接入表達載體pSKB4構(gòu)建表達載體pSKB4-APSK。按照Stratagene的QuikChangeRXL Site-Directed Mutagenesis Kit突變方法（表1）進行R68K突變，所獲載體為pSKB4-APSKR68K。分別轉(zhuǎn)化pSKB4-APSK，pSKB4-APSKR68K入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基（100 mg/L Amp）中37℃過夜培養(yǎng)。第2天重新接種250 mL LB液體培養(yǎng)基（100 mg/LAmp），37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6。將菌液冷卻至16℃，利用IPTG（0.5 mmol/L）16℃誘導培養(yǎng)16 h后，離心收集菌體。進一步參照組氨酸-GST雙標簽融合蛋白純化方法[26]純化APSK，其中所用緩沖液如下。

細胞裂解液：0.40 mol/L KCl，5.0 mmol/Lβ-巰基乙醇，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L Pepstaine A，10 mg/L溶菌酶，50 mmol/L K2HPO4，pH值8.0。鎳柱洗滌液：0.40 mol/L KCl，5.0 mmol/Lβ-巰基乙醇，10 mmol/L咪唑，50 mmol/L K2HPO4，pH值7.3。鎳柱洗脫液：0.40 mol/L KCl，5.0 mmol/Lβ-巰基乙醇，250 mmol/L咪唑，50 mmol/L K2HPO4，pH值7.3。GST洗滌液：0.40 mol/L KCl，5.0 mmol/Lβ-巰基乙醇，50 mmol/L K2HPO4，pH值8.0。GST洗脫液：10 mmol/L GSH，100 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0。透析酶切液：25 mmol/L Hepes，pH值7.5，50 mmol/L KCl，2.0 mmol/L DTT。收集目的蛋白，經(jīng)濃縮、考馬斯亮藍定量后儲存于-80℃冰箱待用。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)所獲蛋白純度大于95%。

表1 克隆及突變引物

1.3.2 酵母YND的克隆及表達純化 以酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因組為模板及PCR引物（YNDf和YNDr，表1）擴增3'，5'-核苷酸酶（yeast 3'，5'-bisphosphate nucleotidase，YND）[12-13]基因。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳割膠回收、純化及雙酶切（Eco R I/Hin d III）連接入表達載體pET24a構(gòu)建表達載體pETND。轉(zhuǎn)化pETND入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基（50 mg/L卡那霉素）中37℃過夜培養(yǎng)。第2天重新接種250 mL LB液體培養(yǎng)基（50 mg/L卡那霉素），37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6。將菌液冷卻至16℃，經(jīng)16 h的IPTG（0.5 mmol/L）誘導蛋白表達后，離心收集菌體。蛋白的純化參照Sun等[26]的方法進行，蛋白的定量參照方法1.3.1，蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)純度大于95%。

1.3.3 APSK及突變體R68K的APS磷酸化活性測定 APSK或者R68K突變體催化APS磷酸化生成PAPS和ADP，生成的ADP可通過PK/LDH體系[27]中的PK磷酸化生成ATP和丙酮酸，丙酮酸可進一步被LDH通過氧化NADH（ε339nm＝0.622 mmol/（L·cm））而還原為乳酸。反應(yīng)的另一產(chǎn)物PAPS可被YND水解為無機磷酸和APS，完成底物APS的再生。利用瓦里安Cary4000分光光度計的kinetic程序，記錄NADH的氧化速度，從而計算酶的活性。反應(yīng)測定體系包括：50 mmol/L Hepes（pH值8.0）；50 mmol/L KCl；1.0 mmol/L ATP；2 mmol/L MgCl2；0.25 mmol/L NADH ；10 U/mL PK；20 U/mL LDH；5 U/mL YND；0.3μmol/L大腸桿菌APSK或R68K；利用不同濃度APS（0.2，0.4，0.6，1.0，1.2，1.4μmol/L）起始反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25℃。平均3次試驗結(jié)果，利用KaleidaGraph軟件（Synergy software，USA）和雙倒數(shù)作圖方程Y＝（Km/Kcat）X＋1/Kcat擬合數(shù)據(jù)，獲得KmAPS以及Kcat。

1.3.4 APSK及突變體R68K的AMP3K活性測定 APSK或者R68K突變體對AMP 3'羥基的磷酸化，產(chǎn)生PAP的同時生成1分子ADP。生成的PAP在YND的催化下可重新脫磷酸化再生成底物AMP。利用上述PK/LDH體系可計算AMP3K的活性。反應(yīng)測定體系包括：50 mmol/L Hepes（pH值8.0）；50 mmol/L KCl；1.0 mmol/L ATP；2mmol/LMgCl2；0.25mmol/LNADH；10 U/mL PK；20 U/mL LDH；5 U/mL YND；0.3μmol/L大腸桿菌APSK或者R68K；利用不同濃度AMP（1.5，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5μmol/L）起始反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25℃。數(shù)據(jù)處理同1.3.3。

1.3.5 YND活性及KmPAP，Kcat的測定 YND催化PAP的水解生成AMP和無機磷酸。在肌激酶（myokinase，MK）的催化下，ATP磷酸化AMP生成2分子ADP，利用PK/LDH體系可計算ADP的生成速度，減半為AMP生成速度即PAP的水解速率。測定條件為：50 mmol/L Hepes（pH值8.0）；50 mmol/L KCl；0.1μmol/L YND；1.0 mmol/L ATP；2 mmol/L PEP；2 mmol/L MgCl2；0.2 mmol/L NADH；5 U/mL MK；10 U/mL PK；20 U/mL LDH；0.5 mmol/LPAP起始反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25℃。

為測定YND水解PAP的動力學常數(shù)，可利用AMP3K活性磷酸化產(chǎn)物AMP，再生成底物PAP，從而維持YND活性測定體系中底物濃度穩(wěn)定，同時消除產(chǎn)物的抑制效應(yīng)。PK/LDH體系和AMP3K的聯(lián)合應(yīng)用，可較為方便進行反應(yīng)初速度測定。R68K作為AMP3K加入YND的動力學常數(shù)測定體系，反應(yīng)條件如下：50 mmol/LHepes（pH值8.0）；50 mmol/L KCl；1.0 mmol/L ATP；2 mmol/LPEP；2 mmol/LMgCl2；0.2 mmol/LNADH；14μmol/L R68K；10 U/mL PK；20 U/mL LDH；5.5 nmol/L YND；利用不同濃度的PAP（0.1，0.2，0.4，0.6，1.0，1.4μmol/L）起始反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25℃。數(shù)據(jù)處理同1.3.3。

1.3.6 大腸桿菌APSK結(jié)構(gòu)的模擬 將大腸桿菌APSK氨基酸序列遞交至SWISS-MODEL workspace網(wǎng)站（http://swissmodel.expasy.org/），選擇利用自動模擬方式，也可提供不同的APSK晶體結(jié)構(gòu)（PDB：1D6J，1M7G，1M7H，3CR7，2GKS，3CR8，4FXP，3UIE，2OFX，2OFW 和1XNJ）作為模板。我們發(fā)現(xiàn)，利用不同模板，大腸桿菌APSK模擬結(jié)果基本一致。本研究以1XNJ為模板，模擬分析大腸桿菌APSK的三維結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 APSK 對APS 和AMP 的磷酸化

APSK催化APS磷酸化生成PAPS和ADP，利用YND[12-13]作為偶聯(lián)酶水解產(chǎn)物PAPS再生底物APS，利用PK磷酸化產(chǎn)物ADP再生底物ATP，方便APS磷酸化的反應(yīng)初速度測定。大腸桿菌APSK的KmAPS和KmATP分別為0.2，10μmol/L[5-6]。在飽和ATP（1 mmol/L）的條件下，APSK的KmAPS和KcatAPS分別為1.78（0.33）μmol/L和22.9（3.1）/min（圖2、表2）。

表2 APSK 和突變體R68K 催化磷酸化反應(yīng)的Km 和Kcat 比較

利用YND水解PAP的3'磷酸基團再生底物AMP，以及PK/LDH測定體系分析APSK是否可催化AMP磷酸化生成PAP。在1 mmol/L ATP的條件下，APSK的KmAMP和KcatAMP分別為14.9（1.9）μmol/L，0.31（0.03）/min（圖2、表2）。APSK的KcatAPS是KcatAMP的74倍，KmAPS是KmAMP的0.12倍。APS是APSK的最適底物，其催化效率是AMP的645倍（表2）。

2.2 R68K 突變的選擇

通過分析已發(fā)表的APSK晶體結(jié)構(gòu)（www.pdb.org），發(fā)現(xiàn)不同來源APSK序列中高度保守的R68可能和APS的硫酸根離子相互作用（圖3），影響APS的親和力。利用R68K的點突變，可能消除R68對APS結(jié)合的促進作用，而較短側(cè)鏈的K側(cè)鏈氨基則可能只與AMP或者APS的α-磷酸基團相互作用，從而將APSK轉(zhuǎn)變?yōu)橐环NAMP 3'羥基激酶。利用突變引物（表1），對R68K進行突變，并經(jīng)測序確認。經(jīng)原核表達純化獲得相應(yīng)R68K突變蛋白。

2.3 R68K 對APS 和AMP 的磷酸化

參照APSK磷酸化APS和AMP的測定條件，R68K的KmAPS和KcatAPS分別為4.6（0.6）μmol/L和1.54（0.18）/min（圖4、表2）。R68K突變的KmAPS為對照的3倍，而KcatAPS降至對照的0.067倍。在1 mmol/LATP的條件下，分別測定R68K的KmAMP和KcatAMP，結(jié)果表明，KmAMP為3.1（0.5）μmol/L，KcatAMP為0.30（0.03）/min（圖4、表2）。R68K突變導致其對AMP的親和力是對照的5倍，而基本沒有影響KcatAMP。因KmAPS增大至KmAMP的1.5倍，導致AMP成為R68K的最適底物。

2.4 YND 水解PAP 的動力學常數(shù)分析

YND催化PAP 3'-磷酸的水解產(chǎn)生AMP，而R68K的AMP3K活性可再生PAP（圖1-A），在消除YND產(chǎn)物的同時，維持底物PAP濃度一定。我們利用R68K作為偶聯(lián)酶，對YND的PAP水解活性進行測定（圖5），獲得與已發(fā)表YND數(shù)據(jù)[15]一致的結(jié)果，KmPAP和KcatPAP分別為0.25（±0.028）μmol/L和6.79（±0.44）/s。

3 討論和展望

APSK催化APS的磷酸化形成PAPS，在硫酸鹽同化代謝過程中具有重要的功能。前人已經(jīng)對多個物種APSK的酶學特性進行了深入研究，青霉菌、擬南芥以及人的APSK的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析（http://www.pdb.org）。不同來源的APSK動力學常數(shù)具有較大差異[5，27-31]，如KmAPS為0.15～4.2μmol/L；KcatAPS為0.1～50/s。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌APSK的KmAPS，KcatAPS分別為1.78μmol/L和22.9/min。

AMP作為APS的類似物，較APS少一個5'硫酸根離子。目前，尚沒有APSK磷酸化AMP的報道。本研究結(jié)果表明，大腸桿菌APSK可磷酸化AMP，但其KcatAMP只有KcatAPS的0.013倍，親和力也較APS低，說明AMP并非APSK的最適底物。細胞內(nèi)AMP濃度為0.15～1 mmol/L[32-33]，KmAMP為15μmol/L說明胞內(nèi)AMP濃度對于AMP3K活性是飽和的。是否在胞內(nèi)合成PAP？研究表明，PAP在胞內(nèi)的累積會影響細胞的生長發(fā)育[12-15，17]，并且AMP3K活性的大量存在會和ND活性形成一個浪費能量的無效循環(huán)，所以，APSK的AMP3K活性可能沒有生物學功能，或者APSK的表達受到嚴緊調(diào)控。

分析模擬的APSK三維結(jié)構(gòu)表明，R68通過和APS的α 磷酸根離子和β 硫酸根離子形成氫鍵，R82通過和APS嘌呤環(huán)的N1以及硫酸根離子形成氫鍵，以及F156和F76與APS嘌呤環(huán)形成芳香環(huán)交互作用（π-stacking），將APS分子固定在酶結(jié)合位點[29，34]。R68可同時和APS的磷酸根離子、硫酸根離子形成氫鍵，K側(cè)鏈基團比R短2.4?，將導致不能和距離較遠的硫酸根離子相互作用，從而減弱APS的親和力，而增加與磷酸根離子的相互作用，從而可能提高AMP的親和力。通過初步的酶學分析表明，R68K突變體降低KmAMP至對照的0.2倍，同時APS磷酸化能力降低為對照的0.067倍。此位點不在催化中心，推測APS活化能力的降低可能由于K與APS的相互作用，導致其3'羥基的空間位置不是ATPγ 磷酸轉(zhuǎn)移的最適位置所致。

R68K突變體使AMP磷酸化的催化效率是對照的5倍，AMP相對于APS成為最適底物。YND催化PAP水解產(chǎn)物為AMP，其Km值較低，約為0.7μmol/L[15]。AMP3K活性可作為YND底物PAP的再生偶聯(lián)酶，維持穩(wěn)態(tài)動力學分析中的底物濃度，同時消除其代謝產(chǎn)物，將反應(yīng)狀態(tài)一直維持在低產(chǎn)物形成的狀態(tài)（反應(yīng)初速度測定條件），有利于準確測定其反應(yīng)速度。本研究利用R68K作為偶聯(lián)酶，成功測定了YND的KmPAP為0.2μmol/L，與已有的研究結(jié)果[15]是一致的。

APSK具有AMP3K的活性，且通過R68K突變體提高其對AMP的催化效率，但仍然較低（0.1μL/（mol·min），所以R68K可認為是非高效的AMP3K。通過進一步分析其結(jié)構(gòu)，將可能分子設(shè)計新的突變位點，提高蛋白對AMP的催化效率，為較低Km的YND動力學分析提供更加有效的偶聯(lián)酶工具。

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