合浦珠母貝基質(zhì)蛋白KRMP-3對二價(jià)金屬離子選擇性的研究

吳 晨, 蘇境坦, 梁 健, 梁 曉, 謝莉萍, 張榮慶

(清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100084)

合浦珠母貝(Pinctada fucata)的貝殼分為角質(zhì)層、棱柱層和珍珠層[1], 是典型的生物礦化產(chǎn)物。雖然棱柱層和珍珠層的組成成分都以碳酸鈣為主(大于95%), 不同的是, 棱柱層中的碳酸鈣晶體為方解石, 而珍珠層中則主要是文石。這種構(gòu)成上的差異主要是由于貝殼中不同礦化蛋白所致。雖然基質(zhì)蛋白只占鈣化層總重量的5%, 但其對生物礦化卻起到非常重要的作用。

基質(zhì)蛋白按其去礦化溶液中的溶解性來分, 可分為可溶性基質(zhì)蛋白(soluble matrix protein)和不可溶性基質(zhì)蛋白(insoluble matrix protein), 按其等電點(diǎn)來分又可分為極酸性基質(zhì)蛋白(等電點(diǎn)小于4.5), 中度酸性基質(zhì)蛋白(等電點(diǎn)為4.5～7)和堿性基質(zhì)蛋白(等電點(diǎn)大于7)[2]。已知的合浦珠母貝基質(zhì)蛋白多為酸性的(Nacrein, Prismalin-14, MSI7等), 堿性基質(zhì)蛋白知之甚少。

KRMP-3基因是從合浦珠母貝外套膜組織中克隆得到的[3], 免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明, KRMP-3蛋白分布于棱柱層中。體外碳酸鈣結(jié)晶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 其能使文石體系結(jié)晶出的碳酸鈣晶貌發(fā)生改變, 同時(shí)出現(xiàn)了少量的方解石小顆粒, 故推測其很可能誘導(dǎo)棱柱層中方解石的形成[6]。

本實(shí)驗(yàn)擬在此研究基礎(chǔ)上, 探究KRMP-3基質(zhì)蛋白誘導(dǎo)方解石形成的機(jī)制, 利用圓二色譜和熒光光譜的方法, 探究KRMP-3基質(zhì)蛋白對不同二價(jià)離子的選擇性, 從而初步解釋其能夠參與生物礦化的原因。圓二色譜是研究蛋白二級結(jié)構(gòu)的常用手段[4]。熒光淬滅法也是研究生物大分子與外界離子相互作用的常用方法之一[5], 通過熒光淬滅法計(jì)算出離子與蛋白的結(jié)合常數(shù)K以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n, 據(jù)此分析蛋白與離子結(jié)合能力的強(qiáng)弱, 從而探究基質(zhì)蛋白在礦化過程中可能起到的作用。

1 材料與方法

1.1 基質(zhì)蛋白KRMP-3的表達(dá)與純化

利用大腸桿菌BL21表達(dá)含有GST標(biāo)簽的KRMP-3蛋白[6]。其中KRMP-3基因是張岑于2006年從合浦珠母貝外套膜組織中克隆得到的, 表達(dá)載體為pGEX-4T-1(Novagen), 培養(yǎng)基采用含有氨芐(100 mg/L)的LB培養(yǎng)基, IPTG濃度為1mmol/L, 誘導(dǎo)溫度為16°C, 誘導(dǎo)時(shí)間為30 h。重組蛋白的純化按GST Gene Fusion System Handbook(Amersham Bioscience)中的方法進(jìn)行操作, 采用GSTrapTMFF (GE Healthcare)柱進(jìn)行分離純化, 其中上樣buffer為50 mmol/L Tris-HCl, 200 mmol/LNaCl, pH 8.0, 洗脫buffer為50 mmol/L Tris-HCL(pH 8.0), 并在其中加入10 mmol/L還原性谷胱甘肽(GSH), 脫鹽buffer為10 mmol/LTris-HCl(pH 8.0), 蛋白的分離純化均用AKATA完成。最后利用試劑盒BCA Protein Assay Kit(Pierce)測量蛋白濃度。

1.2 圓二色譜實(shí)驗(yàn)方法

利用Jasco J-715型圓二色譜儀[7]研究鈣, 鎂離子對基質(zhì)蛋白KRMP-3二級結(jié)構(gòu)的影響。將200 μL含GST標(biāo)簽的KRMP蛋白加入到1 mmol/L比色皿中, 通過圓二色譜儀測其Cd值。之后, 分別加入1 mol/L的CaCl2溶液0.2 μL(鈣離子終濃度為1 mmol/L), 1 mol/L的CaCl2溶液2.0 μL(鈣離子終濃度為10 mmol/L), 1 mol/L的MgCl2溶液0.2 μL(鎂離子終濃度為1 mmol/L), 1 mol/L的MgCl2溶液2.0 μL (鎂離子終濃度為10 mmol/L), 通過圓二色譜儀分別得到其圓二色譜, 通過比較來分析其二級結(jié)構(gòu)的變化。其中J-715型圓二色譜工作參數(shù)為: 波長范圍190～250 nm(有效波長200～250 nm), 25°C, 比色皿光徑1 mm, 分辨率0.2 nm, 掃描速率100 nm/min, 掃描3次取平均值。

1.3 熒光淬滅法

用F-4500 FL Spectrophotometer 研究不同濃度, 不同二價(jià)金屬離子對KRMP-3的影響, 根據(jù)其熒光淬滅程度分析KRMP-3的離子選擇性。將200 μL含GST標(biāo)簽的KRMP蛋白加入到熒光杯中, 測其熒光強(qiáng)度, 之后在蛋白中加入1 mol/LCaCl2溶液, 每次加0.2 μL, 共加6次, 并逐一測其熒光強(qiáng)度, 即可分別得到含不同濃度鈣離子(1～6 mmol/L)的KRMP-3的熒光光譜。同樣方法, 將氯化鈣溶液換成氯化鎂, 氯化鍶, 氯化鋇, 即可得到含不同濃度鎂, 鍶, 鋇的KRMP-3的熒光光譜。其中F-4500 FL Spectrophotometer的工作參數(shù)為: 波長掃描熒光發(fā)射譜, 激發(fā)波長為280 nm, 掃描范圍300～400 nm, 掃描速率 1 200 nm/min, 激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度為10 nm, 電壓400 V, 反應(yīng)時(shí)間2.0 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)蛋白KRMP-3的表達(dá)結(jié)果

用表達(dá)純化獲得的重組蛋白進(jìn)行SDS電泳, 在36 kD處可以看到一條清晰的電泳條帶(圖1)。由于KRMP-3的預(yù)測分子質(zhì)量為9.8 kD, GST標(biāo)簽約為26 kD, 故目標(biāo)蛋白帶GST標(biāo)簽的KRMP-3分子質(zhì)量約為36 kD, 即圖中箭頭所指位置。應(yīng)用BCA法測得蛋白濃度約為0.47 g/L。

圖1 用大腸桿菌表達(dá)含GST標(biāo)簽的KRMP-3蛋白的SDS-PAGE電泳圖 Fig. 1 SDS-PAGE of KRMP-3 protein with GST expressed by E.coli M.marke

2.2 鈣, 鎂離子對基質(zhì)蛋白KRMP-3二級結(jié)構(gòu)的影響

已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示[6], 在文石結(jié)晶體系(含鈣, 鎂離子)中加入高濃度KRMP-3蛋白時(shí), 會(huì)產(chǎn)生少量的方解石。為了確認(rèn)哪種離子起到主要作用, 本實(shí)驗(yàn)利用圓二色譜來研究其與KRMP-3相互作用的情況, 并采用GST蛋白(0.34 g/L)作為空白對照。圖2中顯示的是在KRMP-3蛋白及GST蛋白溶液中分別加入1 mmol/L鈣離子和10 mmol/L鈣離子時(shí)的圓二色譜圖。由圖中可以看到, 當(dāng)加入鈣離子之后, 蛋白質(zhì)的CD值發(fā)生了明顯的變化, 尤其當(dāng)加入高濃度鈣離子時(shí), 蛋白質(zhì)的CD值變化也極為明顯。圓二色譜圖可以反映蛋白的二級結(jié)構(gòu), CD值變化大說明其二級結(jié)構(gòu)改變較大。從KRMP-3的圓二色譜圖的變化可以看到, 鈣離子的加入明顯影響了KRMP-3的二級結(jié)構(gòu), 表明鈣離子與KRMP-3蛋白很可能發(fā)生相互作用。相反, 鎂離子對KRMP-3蛋白的圓二色譜圖卻沒有影響(圖3)。從對照組可以看到, 無論加入鈣離子還是鎂離子, 其對GST蛋白的圓二色譜圖都基本沒有改變。由此可以說明, 鈣離子可能同KRMP-3蛋白發(fā)生相互作用, 從而改變其二級結(jié)構(gòu)。

2.3 熒光淬滅法研究KRMP-3蛋白的離子選擇性

圓二色譜實(shí)驗(yàn)顯示了KRMP-3蛋白對鈣離子具有結(jié)合能力, 為了進(jìn)一步確認(rèn)其對鈣離子是不是具有選擇性, 本文另外選取了與鈣同族的鎂, 鍶, 鋇等 二價(jià)金屬離子作為淬滅劑, 利用熒光淬滅法研究KRMP-3蛋白對離子的選擇性。

圖2 不同濃度鈣離子對KRMP-3蛋白及GST二級結(jié)構(gòu)的影響 Fig. 2 Effect of different concentrations of Ca ion on the secondary structure of KRMP-3 protein and GST

圖3 不同濃度鎂離子對KRMP-3蛋白及GST二級結(jié)構(gòu)的影響 Fig. 3 Effect of different concentrations of Mg ion on the secondary structure of KRMP-3 protein and GST

生物大分子含有熒光基團(tuán)(KRMP-3中主要是色氨酸), 加入外界離子后可能發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象, 這種現(xiàn)象可以間接說明蛋白與離子相互作用的強(qiáng)弱[5]。圖4～圖7分別顯示了在KRMP-3蛋白溶液中加入了不同濃度的鈣, 鎂, 鍶, 鋇離子后熒光淬滅程度的變化。從圖中可以清楚地看到, 在加入了一系列濃度梯度的鈣離子后, KRMP-3的熒光強(qiáng)度發(fā)生了顯著的淬滅現(xiàn)象, 且其峰值隨著濃度的增加有規(guī)律的遞減; 而加入鎂, 鍶, 鋇等離子后, 雖然也發(fā)生了小幅度的熒光淬滅, 但其淬滅程度要小于鈣離子, 且其峰值并沒有出現(xiàn)規(guī)律性的遞減。對照組為GST蛋白的熒光光譜圖, 從圖中可以看到, 當(dāng)加入鈣, 鎂, 鍶, 鋇離子后, 其熒光強(qiáng)度基本不發(fā)生變化, 說明前面的熒光淬滅是由KRMP-3蛋白引起的, 鈣離子更容易與KRMP-3蛋白結(jié)合, 從而使得熒光強(qiáng)度降低。由此可見, KRMP-3蛋白確實(shí)更“偏愛”于鈣離子。結(jié)合圓二色譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 我們發(fā)現(xiàn), 鈣離子對KRMP-3的結(jié)構(gòu)影響要大于其他離子, 說明KRMP-3對鈣離子可能具有一定的選擇性。

2.4 KRMP-3蛋白與鈣離子結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n的計(jì)算

為了確認(rèn)KRMP-3與鈣離子結(jié)合能力的強(qiáng)弱, 本實(shí)驗(yàn)對鈣離子結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n進(jìn)行了計(jì)算。熒光淬滅的機(jī)理可以分為動(dòng)態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅[8-9]。動(dòng)態(tài)淬滅遵循Stern-Volmer方程:I0/I=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]。其中I0和I分別表示未加入淬滅劑(本實(shí)驗(yàn)中的二價(jià)離子)和加入淬滅劑之后的熒光強(qiáng)度, [Q]表示淬滅劑濃度,Kq為雙分子淬滅過程速率常數(shù),τ0為無淬滅劑時(shí)的分子平均壽命,Ksv為Stern-Volmer淬滅常數(shù)。由此可見, 假設(shè)鈣離子使KRMP-3蛋白發(fā)生熒光淬滅是由動(dòng)態(tài)淬滅引起的, 那么I0和I比值會(huì)和鈣離子濃度成正比, 故選取波長為346 nm的熒光強(qiáng)度, 以鈣離子濃度為橫坐標(biāo), 熒光強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)作圖, 得到圖8。

圖4 含有不同濃度鈣離子的KRMP-3蛋白及GST的熒光光譜 Fig. 4 The fluorescence spectra of KRMP-3 protein and GST with different concentrations of Ca ion

圖5 含有不同濃度鎂離子的KRMP-3蛋白及GST的熒光光譜 Fig. 5 The fluorescence spectra of KRMP-3 protein and GST with different concentrations of Mg ion

圖6 含有不同濃度鍶離子的KRMP-3蛋白及GST的熒光光譜 Fig. 6 The fluorescence spectra of KRMP-3 protein and GST with different concentrations of Sr ion

圖7 含有不同濃度鋇離子的KRMP-3蛋白及GST的熒光光譜 Fig. 7 The fluorescence spectra of KRMP-3 protein and GST with different concentrations of Ba ion

圖8 動(dòng)態(tài)淬滅擬合曲線 Fig. 8 The fitting curve of dynamic quenching

由圖中擬合的線性方程可以得到Ksv為305.9 L/mol, 而生物大分子理論最大值Ksv是小于100 L/mol的, 故可認(rèn)為由鈣離子導(dǎo)致的熒光淬滅不是動(dòng)態(tài)淬滅, 而是由靜態(tài)淬滅。

仿照文獻(xiàn)[10-11]中的方法來計(jì)算結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。假設(shè)游離的KRMP-3蛋白的濃度為[P], 淬滅劑鈣離子的濃度為[Q], 假設(shè)蛋白與鈣離子有n個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn), 則當(dāng)加入鈣離子之后, 蛋白與n個(gè)鈣離子形成蛋白復(fù)合體, 即QnP, 其結(jié)合常數(shù)

設(shè)加入鈣離子后, 蛋白的總濃度為[P0], 即[P0]=[P]+[QnP], 由于蛋白的摩爾濃度遠(yuǎn)小于鈣離子, 故平衡時(shí)鈣離子的濃度近似等于初始濃度, 因此(1)式可改寫為

在靜態(tài)淬滅中, 由于生成的配合物是非熒光性的, 故熒光強(qiáng)度與溶液中游離的蛋白質(zhì)濃度成正比, 即

結(jié)合(2)和(3)可以得到

從(4)中可以看到, lg(I0/I-1) 和lg[Q]成線性關(guān)系, 以lg[Q]為橫坐標(biāo), lg(I0/I-1)為縱坐標(biāo)作圖, 可以得到圖9。

由圖中擬合的線性方程可以得知,n≈1.23 ,K≈103L/mol,R2=0.997 。

圖9 靜態(tài)淬滅擬合曲線 Fig. 9 The fitting curve of static quenching

3 討論

KRMP-3是位于合浦珠母貝棱柱層的一種堿性基質(zhì)蛋白, 圓二色譜和熒光光譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了KRMP-3對鈣離子具有選擇性。利用方程計(jì)算得到KRMP-3與鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)近似為1, 結(jié)合常數(shù)約為103L/mol, 說明KRMP-3與鈣離子的結(jié)合程度并不是很強(qiáng), 這或許可以解釋KRMP在貝體內(nèi)的生理功能。這種與鈣離子中等的結(jié)合強(qiáng)度使得KRMP-3既可以從海水中特異性地捕捉鈣離子, 又可以在一定條件下釋放出所結(jié)合的鈣離子以促進(jìn)碳酸鈣方解石晶體的形成, 從而從結(jié)構(gòu)方面說明了KRMP-3是有可能參與棱柱層的形成的。

此外, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, KRMP-3對鈣離子是具有明顯的選擇性的。當(dāng)碳酸鈣結(jié)晶體系中的鎂離子含量達(dá)到一定程度時(shí), 結(jié)晶出來的碳酸鈣晶體是文石, 而在海水中鈣, 鎂離子都存在的條件下, 貝殼中的棱柱層依然能形成這種棱柱狀的方解石晶體, 這很有可能是棱柱層存在著一些蛋白, 他們能特異性的識別鈣離子, KRMP-3就很有可能具有這種功能。有結(jié)果顯示[6], 當(dāng)在含有鎂離子的碳酸鈣結(jié)晶體系中加入KRMP-3時(shí), 文石的晶貌會(huì)出現(xiàn)明顯的變化, 同時(shí)還有少量小顆粒的方解石產(chǎn)生。而本實(shí)驗(yàn)顯示的KRMP-3對鈣離子的選擇性可以初步解釋這種現(xiàn)象。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測, KRMP-3之所以具有調(diào)節(jié)棱柱層中方解石形成的作用原因在于KRMP-3對鈣離子的選擇性, 它能夠特異地捕捉海水中的鈣離子, 將其“搬運(yùn)”到貝殼中, 并在合適的條件下釋放出鈣離子, 使在棱柱層形成的微區(qū)間內(nèi)形成一個(gè)類似于方解石形成的體系(無鎂), 從而誘導(dǎo)方解石的形成。

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