利用改良的氨基酸測定方法檢測野生紅小豆（Vigna angularis）品系氨基酸含量

彭 海，張 靜，陳禪友

（江漢大學 系統(tǒng)生物學研究院； 湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心，湖北 武漢 430056）

紅小豆又名紅豆、赤小豆或赤豆，其具有降低膽固醇［1－3］、調節(jié)人體雌激素水平［4］、用作中草藥［5］等功能，用途十分廣泛。紅小豆起源于我國，資源十分豐富。本研究在武漢市蔡甸區(qū)洪北鄉(xiāng)勝洪村發(fā)現(xiàn)了一個野生紅小豆種群，并對其進行了表型性狀調查，發(fā)現(xiàn)在色澤、種子大小、株高等方面存在明顯變異［6］。經(jīng)過分株單選，從這個野生紅小豆種群中獲得了10 個品系。

紅小豆含有超過20%的蛋白質和各種氨基酸，人體必須賴氨酸含量也較高，因此，氨基酸含量是紅小豆品質的一個重要指標。雖然傳統(tǒng)的紅小豆測定方法有液相色譜法和比色法兩種方法，但前者設備與試劑費用都較高，難以大量推廣，而后者操作所需要的液體體積較大，比較粗放，誤差較大，也難以實現(xiàn)自動化與批量處理。為此，在本研究中，對傳統(tǒng)的比色法測定氨基酸含量進行了改良，使操作體積縮小到微升級別，使操作方便程度大大提高，結果精度也顯著改善，同時降低了成本，也有助于自動化操作。利用改進的方法，測定了所篩選的10 個紅小豆品系的氨基酸含量，為育種選擇奠定了基礎。

1 實驗部分

1.1 材料

10 個初步篩選的野生紅小豆品系，分別編號為S1 ～S10，于2012 年在海南統(tǒng)一繁殖獲得種子。

1.2 儀器

全波段超微量分光光度計（QuanWell，Q5000 型）；PCR 儀（ABI，2700 型）；恒溫金屬?。∕iniT－100，杭州奧盛儀器有限公司）。

1.3 試劑

3%茚三酮試劑、氰酸鹽緩沖液、標準氨基酸、0.3%抗壞血酸溶液。

1.4 標準曲線的制備

取0. 2 mL PCR 管18 支，按表1 加入各試劑，震蕩混勻，在PCR 儀中100 ℃保溫12 min，取出后立即置冰上，于每支PCR 管中加入150 μL 95%乙醇，震蕩混勻，使加熱時形成的紅色產物被氧化而褪色，此時溶液呈藍紫色。于570 nm 波長下測其光密度（以空白管為參比），以氨基酸濃度為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線，求出直線方程。

1.5 樣品制備

取30 個1. 5 mL 的EP 管，稱量空管的重量，選取S1 ～S10 紅小豆各3 粒，分別置于30 個EP 管中，用帶研磨杵的電鉆將樣品研磨成粉狀，再稱量各EP 管重量，減去空管的重量，即為加入紅小豆的重量。向EP 管中加蒸餾水1 mL，于恒溫金屬浴100 ℃加熱20 min 以提取游離氨基酸，之后置冰上冷卻，1 000 r/min 離心1 min，取上清于另一干凈的1. 5 mL EP 管中，恒溫金屬浴上100 ℃加熱10 min，用水補至1.5 mL。

1.6 樣品測定

取33 支PCR 管，其中30 支分別加入S1 ～S10的提取液5 μL，另外3 支加5 μL 蒸餾水，然后在上述33 支PCR 管中分別加入NaCN 緩沖液、水合茚三酮各5 μL，置PCR 儀中100℃保溫12 min，取出立即置冰上冷卻，分別加50 μL 95%乙醇，搖勻，以空白作參比，在波長570 nm 下測其光密度。根據(jù)光密度查標準曲線（或用回歸方程計算），求出提取液中氨基酸濃度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

式中，C 為由直線方程計算的值，即氨基酸濃度（nmol/μL）；V 為樣品提取液經(jīng)稀釋后的總體積（μL）=1500 μL；W 為樣品重（g）。

2 結果與分析

2.1 氨基酸標準曲線

采用超微量分光光度計進行吸光度值的測定，由于最后測定只需要1 μL 的量。因此，在制定標準曲線時，各反應組份體積都控制在15 μL以內，測定結果見表1。從表1 可以看出：標準品的吸光度變異較小，均不超過0.000 2，表明改進方法的技術重復內是穩(wěn)定的。根據(jù)表1 的結果，進行了線性回歸分析，結果如圖1 所示，獲得了吸光度與氨基酸濃度之間的線性回歸方程為：Y=0.5561x ＋0.0049。該線性回歸方程的相關系數(shù)高達99. 81%，表明本研究建立的回歸方程可靠，從另一側面反應了本研究改進方法的可靠性。

表1 氨基酸標準曲線的測定

圖1 氨基酸濃度標準曲線

2.2 野生紅小豆品系氨基酸含量

利用改進的氨基酸測定方法，對10 個紅小豆品系進行了測定，結果見表2。利用表2 結果進行了統(tǒng)計分析，計算了各品系氨基酸含量的平均值、標準差，并在1%和5%的水平進行了多重比較，結果見表3。從表3 可以看出：所篩選的10個紅小豆品系的氨基酸含量存在明顯差異，最高是S10，達到222. 95 μg/g，最低是S5，為191. 53 μg/g。該批紅小豆是從野生紅小豆種群中篩選出來的，從形態(tài)等方面看，多樣性較高［6］，推測在氨基酸含量方面，可能存在較大變異，本研究證實了這一點。從統(tǒng)計分析結果來看，不論是在5%還是1%的顯著水平上，這10 個野生紅小豆品系間的氨基酸含量差異都達到了顯著水平，表明它們之間的氨基酸含量差異是真實存在的，育種篩選是可行的。

表2 S1～S10 紅小豆品系氨基酸含量測定結果

表3 S1～S10 紅小豆品系氨基酸含量統(tǒng)計分析

3 討論

3.1 氨基酸測定方法的改進

傳統(tǒng)的氨基酸測定方法采用比色皿進行比色，測定時需要的體積至少為1 mL，這方面的實例很多［7－8］。另外一些學者則采用液相色譜進行測定［9－10］。液相色譜不論是在儀器還是試劑成本上，都是一般實驗室難以接受的。比色法成本較低，采用更為普遍。然而，傳統(tǒng)的比色法由于操作體積都在毫升級別，所需液體體積較大，所以，在配制反應液時，必須在試管中進行，取樣需要移液管進行操作，加熱等也必須在水浴鍋中進行。所有這些操作都耗時且不方便，水浴加熱不精確，冷卻過程也較長，這些都是實驗誤差的來源，使得測量不夠準確。本研究中，采用超微量分光光度計進行比色，其突出特點是可以將比色的體積減少到1 μL，即僅為傳統(tǒng)檢測體積的1/1 000，從而使得整個反應可以在PCR 管中進行，所有操作體積都控制在150 μL 之內，使得整個移液工作可以采用移液槍進行，方便、快捷、準確度高。另外，整個標準曲線和樣品測定的反應總體積在100 μL 以內，可以在PCR 儀中對加熱溫度和時間進行精確控制。當樣品數(shù)目較多時，可以采用PCR 板進行。這一改進使得所有樣品加熱和冷卻可以同時開始、同時結束，保證了樣品間的可對比性。另外，也可以將PCR 儀中加熱和冷卻按程序進行，即100 ℃加熱12 min 后，設置一個4 ℃保存程序，進一步減少了手工操作。從標準曲線的測定來看，重復間變異很小，曲線方程相關系數(shù)達到99. 81%，反映了測定的準確性。

另外，上述改進之后，加樣可以利用移液工作站自動進行，加熱與冷卻可利用PCR 儀自動進行，使氨基酸測定自動化與標準化程度大大提高。在食品抽查中有大量樣品需要檢測，若能實現(xiàn)自動化與標準化，對于檢測結果的準確性與及時性都有極大好處，因此，本研究所改進的方法在食品氨基酸檢測方面具有潛在的利用價值。

最后，上述改進后，試劑的消耗量減少了數(shù)百倍，試驗成本大大降低。

3.2 野生紅小豆品系氨基酸含量

從已有文獻來看，還沒有紅小豆氨基酸含量的文獻報道。查詢了中國作物種質信息網(wǎng)（http：//icgr.caas.net.cn），從現(xiàn)有保存的839 份紅小豆資源來看，氨基酸含量在本研究的變異范圍內（222. 95 ～191. 53 μg/g）的資源有522 份，占總資源的62. 22%；小于本研究下限191. 53 μg/g的品系有16 個，占1. 91%；大于本研究的上限222.95 μg/g 的品系有301 個，占35.88%。表明本研究篩選的野生資源中，氨基酸的含量雖然有較大變異，但還是沒有能夠超過已有資源的氨基酸含量。另外，低于本研究下限的種質資源數(shù)量已經(jīng)很少了，從一個側面說明，本研究的野生資源的氨基酸含量總體偏低，育種改良空間較大。可與該網(wǎng)站中所登記的高氨基酸含量的親本進行雜交，從后代篩選出氨基酸含量高且具有野生資源優(yōu)良抗性的品系，從而實現(xiàn)紅小豆氨基酸含量改良的育種目標。

［1］ Nishi S，Saito Y，Souma C，et al. Suppression of serum cholesterol levels in mice by Adzuki bean polyphenols［J］. Food Science and Technology Research，2008，14（2）：217－220.

［2］ Kojima M，Nishi S，Yamashita S，et al. Smaller increase in serum cholesterol level in rats fed an ethanol extract of Adzuki bean seeds［J］. Journal－Japanese Society of Food Science and Technology，2006，53（7）：380－385.

［3］ Souma C，Okumura O，Kato J. Effects of hot water extract of Adzuki bean on physiological functions of human subjects［J］. Bulletin of Hokkaido Prefectural Agricultural Experiment Stations（Japan），2007，91：23－29.

［4］ Boue S M，Wiese T E，Nehls S，et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens［J］. J Agric Food Chem，2003，51（8）：2193－2199.

［5］ 張福生，王海英，桑英. 有機紅小豆高產栽培［J］. 內蒙古農業(yè)科技，2009（1）：106.

［6］ 張靜，彭海，魏傳斌，等.野生紅小豆群落形態(tài)調查與利用研究［J］. 華中師范大學學報：自然科學版，2012，46（3）：343－346.

［7］ 傅維，孫勇民，王芃.黑米發(fā)芽過程中色素及氨基酸含量變化研究［J］. 安徽農業(yè)科學，2012，40（3）：1476－1478.

［8］ 楊遠帆，倪輝，吳黎明. 茚三酮法測定蜂蜜及果葡糖漿中的氨基酸含量［J］. 中國食品學報，2013（2）：171.

［9］ 李琪，李廣，張會妮.柱后衍生法測定蘭州百合中氨基酸含量［J］.中國食物與營養(yǎng)，2013（2）：68－71.

［10］車蘭蘭，李衛(wèi)華，林勤保，等. 蘆筍不同顏色、粗細和部位的游離氨基酸含量［J］. 食品科學，2013，34（1）：65－68.