GJB2基因條件敲除小鼠的繁殖、基因型鑒定及聽力檢測△

萬亞蕊 張延平 張曉強(qiáng) 楊仕明

全國性耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國大多數(shù)重度以上非綜合征型聾（nonsyndromic hearing loss，NSHL）由為數(shù)不多的幾個(gè)基因突變所致，其中，最常見的致聾基因是GJB2 基因，21% 的耳聾患者攜帶該基因突變［1］。GJB2基因突變主要導(dǎo)致先天性NSHL，為常染色體隱性遺傳。在中國人中，已檢出26%～33%的兒童語前聾患者為GJB2突變所致，占常染色體隱性遺傳性聾的28%［2］，目前GJB2突變導(dǎo)致耳聾的確切機(jī)制還不完全清楚。GJB2基因位于染色體13q12，編碼縫隙連接蛋白26（connxin 26，Cx26）是構(gòu)成細(xì)胞間縫隙連接（gap junction）的重要組成部分，Cx26在哺乳動(dòng)物耳蝸中廣泛存在，它所構(gòu)成的縫隙連接在維持耳蝸正常生理功能中起重要作用。本研究引進(jìn)兩對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠，即Cx26loxp／loxp 和Pax2－Cre／＋小鼠，以便雜交獲得GJB2基因條件敲除（conditional connexin 26knock out，cCx26KO）小鼠，為國內(nèi)進(jìn)一步研究GJB2基因突變導(dǎo)致耳聾的機(jī)理提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠引進(jìn)自美國Emory大學(xué)林曦教授實(shí)驗(yàn)室。Cx26loxp／loxp小鼠由胚胎干細(xì)胞同源重組產(chǎn)生，其中編碼Cx26 的第二外顯子兩側(cè)插入有新霉素選擇位點(diǎn)和loxp片段，構(gòu)建打靶載體，將其轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞內(nèi)通過同源重組代替原來的基因序列，經(jīng)過處理的胚胎干細(xì)胞植入假孕小鼠的子宮內(nèi)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠Cx26loxp／loxp。Pax2－Cre／＋小鼠的獲得：首先將小鼠Pax2 基因編碼序列上游101kb的序列和前三個(gè)外顯子序列共計(jì)121 kb長的基因片段插入細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）中，然后細(xì)菌的同源重組作用將IRES－Cre－polyA 插入Pax2基因外顯子2中構(gòu)建打靶載體，通過受精卵原核注射最終產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠Pax2－Cre／＋。將Cx26loxp／loxp和Pax2Cre／＋交配，獲得的子代Cx26loxp／－ ＿Pax2Cre／＋小鼠再與Cx26loxp／loxp小鼠交配即可獲得 GJB2 基因條件敲除（cCx26KO）小鼠Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋。

1.2 小鼠的飼養(yǎng)和繁殖 引進(jìn)的小鼠飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房中，室內(nèi)溫度20～26℃，濕度40%～70%，采用12小時(shí)周期晝夜交替照明，小鼠籠盒每周進(jìn)行一次消毒處理，墊料、飼料和飲水均經(jīng)過高溫高壓Co照射滅菌處理；飼養(yǎng)期間，研究員需身穿隔離衣、戴帽子、手套進(jìn)入動(dòng)物房，墊料每周換2～3次，每天補(bǔ)充食水一次，記錄環(huán)境因素，密切觀察小鼠的生長繁殖情況。小鼠的性周期為60d左右，母鼠的妊娠期為19d左右，雜合子小鼠Cx26loxp／－＿Pax2－Cre／＋和Pax2－Cre／＋小鼠合籠繁殖，以獲得更多的Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋實(shí)驗(yàn)用基因敲除動(dòng)物。

1.3 小鼠的基因型鑒定 由于小鼠Cx26loxp／loxp和Pax2－Cre／＋、雌性小鼠Cx26loxp／＋＿Pax2－Cre／＋和雄性小鼠Cx26loxp／loxp的后代分別可產(chǎn)生兩種和四種基因型，故需對(duì)子代進(jìn)行基因型鑒定。

1.3.1 鼠尾基因組DNA 的提取 對(duì)出生6天左右未斷乳小鼠斷趾進(jìn)行編號(hào)，剪取小鼠尾尖0.5～1 cm 放入滅菌的Eppendorf管中，內(nèi)盛有200μl直接PCR 組織裂解液和4 mg蛋白酶K，混勻后在金屬浴中55℃下旋轉(zhuǎn)試管10小時(shí)，使其溶解充分，嚴(yán)格按照Phire 動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒（Thermo Fisher Scientific，芬蘭）說明書進(jìn)行操作。EP管內(nèi)加入0.25μl DNARelease添加劑，渦旋振蕩并離心，直至完全溶解。室溫放置2～5 min，預(yù)熱（98 ℃）下孵育2min，離心；移上清至一新管，直接進(jìn)行PCR 鑒定。

1.3.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及電泳 引物設(shè)計(jì)分別由上海生工合成。引物序列：引物A 上游序列l(wèi)oxpF：5＇－CTT TCC AAT GCT GGT GGA GTG－3＇，下游序列l(wèi)oxpR：5＇－ACA GAA ATG TGT TGG TGA TGG－3＇；引物B上游序列Cre－F：5＇－AGC TAA ACA TGC TTC ATC GTC GGT C－3＇，下游序列Cre－R：5＇－TAT CCA GGT TAC GGA TAT AGT TCA TG－3＇。采用PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，設(shè)置的反應(yīng)條件為：反應(yīng)總體系為10μl，預(yù)變性94 ℃5min后，94 ℃變性30s，60～62℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8min，4 ℃保持。取PCR 反應(yīng)終產(chǎn)物3 μl在1%瓊脂糖凝膠電泳，Mark作為DNA 分子量標(biāo)記物，10V／cm 進(jìn)行電泳，全自動(dòng)凝膠圖像系統(tǒng)分析成像并保存。

1.4 c－ABR 檢測 選取P23（出生后24天）的敲基因小鼠和野生型小鼠，使用10%水合氯醛麻醉，置于固定架上，在隔聲屏蔽室內(nèi)用EP 誘發(fā)電位儀（TDT）對(duì)小鼠行c－ABR 檢測。記錄電極置于頭頂，參考電極插于對(duì)側(cè)耳垂，地極置于鼻尖，聲音由距小鼠外耳廓1cm 的耳機(jī)傳入，采用寬頻帶短聲刺激，平均疊加次數(shù)1 024次，掃描時(shí)間25ms，野生型小鼠先以90dB SPL 刺激，10dB遞減，接近閾值時(shí)以5dB遞減；敲基因小鼠以95dB SPL 刺激，逐級(jí)遞減并重復(fù)2次。以剛能引出可重復(fù)波Ⅲ的最低刺激強(qiáng)度為反應(yīng)閾值。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型的鑒定 Cx26loxp／－＿Pax2－Cre／＋與Cx26loxp／loxp雜交后產(chǎn)生的子代應(yīng)用2組特異性引物鑒別基因型，子代小鼠基因型PCR 鑒定部分結(jié)果見圖1，14、18編號(hào)小鼠為loxp引物出現(xiàn)一條322bp 擴(kuò)增條帶，為Cx26loxp／loxp 純合；15、16、17編號(hào)小鼠出現(xiàn)兩條288bp和322bp擴(kuò)增條帶，為Cx26loxp／－雜合；15、16、18編號(hào)小鼠Cre引物擴(kuò)增的結(jié)果出現(xiàn)700bp的擴(kuò)增條帶，為Pax2－Cre／＋，14、17等未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，為Pax2－Cre陰性。證明18號(hào)小鼠的基因型為Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋，為cCx26KO 小鼠，可作為今后實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物模型。

2.2 各種基因型小鼠的繁殖情況 通過親代Cx26loxp／loxp和轉(zhuǎn)基因小鼠Pax2－Cre／＋配對(duì)，成功地繁殖出子代小鼠，每胎約5～6只，成活率＞93%，其基因型分別為Cx26loxp／－＿Pax2－Cre／＋或者Cx26loxp／－，各占50%，Cx26loxp／－＿Pax2－Cre／＋小鼠與Cx26loxp／loxp小鼠再次雜交，子代經(jīng)PCR 鑒定共有四種基因型，即Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋、Cx26loxp／－ ＿Pax2－Cre／＋、Cx26loxp／loxp、Cx26loxp／－ 各 占 約 25%，Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋即為cCx26KO 小鼠。以上繁殖結(jié)果均符合孟德爾遺傳定律。各種基因型代表的含義見表1。

圖1 Cx26條件誘導(dǎo)性敲除小鼠PCR 基因分型鑒定結(jié)果

表1 各種基因型代表含義

2.3 ABR 檢測結(jié)果 c－ABR 檢測結(jié)果顯示野生型小鼠ABR 波形規(guī)則，隨著刺激強(qiáng)度逐漸降低，波Ⅲ振幅逐漸降低、潛伏期逐漸延長，反應(yīng)閾約45dB SPL。而cCx26KO 小鼠在90dB SPL 刺激強(qiáng)度下仍未見到明顯的波Ⅲ，繼續(xù)加大刺激聲強(qiáng)度至95 dB SPL后出現(xiàn)形狀欠規(guī)則的波Ⅲ，說明與野生型小鼠相比，敲基因小鼠的ABR 反應(yīng)閾明顯增高。

3 討論

基因敲除又稱基因打靶或定點(diǎn)同源重組，是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來的新興技術(shù)，它是通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因?yàn)槟康牡囊豁?xiàng)技術(shù)，通過條件基因打靶還可以實(shí)現(xiàn)在特定的時(shí)間和特定的基因位點(diǎn)不表達(dá)目的基因，為生物醫(yī)學(xué)和臨床遺傳病的研究提供了全新的研究手段。本實(shí)驗(yàn)從國外引進(jìn)Cx26loxp／loxp、Pax2－Cre／＋兩種轉(zhuǎn)基因小鼠，在國內(nèi)繁殖GJB2基因條件敲除小鼠模型，并對(duì)此類模式動(dòng)物的繁殖和基因型鑒定規(guī)律進(jìn)行探索。

GJB2基因廣泛表達(dá)于內(nèi)耳、肝臟、胎盤等組織中，構(gòu)成的縫隙連接是細(xì)胞之間重要的通訊聯(lián)絡(luò)通道。完全剔除GJB2基因后將導(dǎo)致胎盤葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷，導(dǎo)致敲基因小鼠胚胎期死亡［3］，因此只能采用條件基因敲除方法獲得GJB2基因敲除小鼠。實(shí)現(xiàn)內(nèi)耳條件基因敲除首先需要Cre－loxp系統(tǒng)，其次還需要在內(nèi)耳特異性表達(dá)的基因擔(dān)任Cre重組酶的驅(qū)動(dòng)子。Cre－loxp系統(tǒng)是噬菌體P1 的位點(diǎn)專一性重組系統(tǒng)，Cre重組酶是重組酶Int 家族中的成員，能介導(dǎo)兩個(gè)同向的loxp位點(diǎn)間DNA 片斷的特異性切除。Pax2基因編碼核轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育階段廣泛表達(dá)于中腦－后腦邊界、腎臟、視泡、脊柱、嗅基板和耳板組織中，Pax2是內(nèi)耳原基耳板的早期標(biāo)記物之一，幾乎在每個(gè)發(fā)育的耳囊細(xì)胞中都有表達(dá)，因此被研究者選為產(chǎn)生基因條件敲除小鼠的定位基因［4］。由于構(gòu)建的載體中含有Pax2基因的啟動(dòng)子和內(nèi)耳特異性表達(dá)成分以及Cre，因此在構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，Cre 重組酶便被特異性地在內(nèi)耳發(fā)育時(shí)表達(dá)，若此時(shí)遇到同時(shí)在內(nèi)耳表達(dá)的兩個(gè)同向loxp／loxp，便可特異性將內(nèi)耳中兩個(gè)loxp／loxp之間的Cx26基因特異性切除，從而產(chǎn)生僅耳蝸缺失該基因的條件基因敲除小鼠。

在動(dòng)物繁殖中，本研究先將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Cx26loxp／loxp 和Pax2－Cre／＋進(jìn)行交配，由于Cx26loxp／－＿Pax2－Cre／＋的雄性小鼠無繁殖能力，因此子代中基因型為Cx26loxp／－＿Pax2－Cre／＋的雌性小鼠再與Cx26loxp／loxp 雄性小鼠進(jìn)行雜交，即可得到刪除外源標(biāo)記基因的條件性敲除小鼠Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋。

由于需要從后代中挑選特異性基因敲除小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故必須進(jìn)行基因型鑒定。根據(jù)loxp 與Cre重組酶的敲除原理，只要在基因組DNA 中檢測loxp 位點(diǎn)和Cre 重組酶基因的有無就可判斷幼鼠的基因型。對(duì)突變小鼠進(jìn)行鑒定的常用方法包括Southern雜交和PCR 法，最常用的簡便而快捷的方法為PCR 法?；蛐丸b定分為直接法和間接法兩種，直接從耳蝸組織提取DNA 進(jìn)行PCR 為直接基因型鑒定，但取材復(fù)雜，通常用作獲得基因型后的下游實(shí)驗(yàn)［5］。由于獲取轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)已經(jīng)將loxp和Cre基因插入動(dòng)物的基因組DNA，雖然上述兩個(gè)基因不在鼠尾組織中表達(dá)，但可以通過PCR 方法檢測其基因序列的存在，故可用鼠尾組織進(jìn)行基因型鑒定。本研究用于基因型鑒定的PCR 引物設(shè)計(jì)時(shí)，將引物A 的上游序列定位于Cx26第二外顯子的上游，引物A 的下游序列定位于Cx26第二外顯子的中間［6］，loxp的長度約為20bp，因此loxp純合則有322bp 條帶，loxp 雜合則有322bp 和288bp 兩條條帶；野生型不含loxp位點(diǎn)，則只有288bp的一個(gè)條帶，即：loxp／loxp=322bp，wt／wt=288bp，wt／loxp=288bp＋322bp；基因組有Cre插入則出現(xiàn)700bp的條帶，否則沒有條帶。

通過對(duì)小鼠ABR 檢測結(jié)果顯示，隨著刺激強(qiáng)度的增加，野生型小鼠ABR 的波Ⅲ分化良好，反應(yīng)閾基本正常，而基因敲除小鼠Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋在刺激強(qiáng)度達(dá)到90dB SPL時(shí)未引出典型的波Ⅲ，繼續(xù)增加刺激強(qiáng)度波形分化仍差，說明Cx26敲基因小鼠在P23 時(shí)聽力顯著下降，證實(shí)了PCR 方法的可行性以及鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。此結(jié)果與前期研究發(fā)現(xiàn)此種小鼠模型在P18（出生后第19天）時(shí)出現(xiàn)典型的外毛細(xì)胞凋亡、在P21（出生后第22 天）時(shí)外毛細(xì)胞片狀缺失相一致［7］。說明GJB2基因的缺失可導(dǎo)致小鼠內(nèi)耳縫隙連接通道功能受損，引起內(nèi)耳細(xì)胞凋亡，使小鼠表現(xiàn)為重度或極重度的感音神經(jīng)性聽力損失。

本研究成功地對(duì)Cx26loxp／loxp、Pax2－Cre／＋小鼠進(jìn)行了保種和繁育，并探索出了此類小鼠的繁殖、基因型鑒定的規(guī)律，為在國內(nèi)進(jìn)行非綜合征型聾發(fā)病機(jī)制的研究提供了模式動(dòng)物。

1 Dai P，Yu F，Han B，et al.GJB2mutation spectrum in 2063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment［J］.J Transl Med，2009，7：1.

2 韓明昱，戴樸.我國耳聾基因診斷的臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.北京醫(yī)學(xué)，2011，33：419.

3 Gabriel HD，Jung D，Bützler C，et al.Transplacental uptake of glucose is decreased in embryonic lethal connexin26－deficient mice［J］.J Cell Biol，1998，140：1 453.

4 Ohyama T，Groves AK.Generation of Pax2－Cre mice by modification of a Pax2 bacterial artificial chromosome［J］.Genesis，2004，38：195.

5 郝海邦，楊承忠，岳碧松.條件性基因敲除：骨髓細(xì)胞特異性敲除Ncol2 基因小鼠的建立和基因型鑒定［J］.四川動(dòng)物，2011，30：961.

6 Cohen－Salmon M，Ott T，Michel V，et al.Targeted ablation of connexin26in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death［J］.Curr Biol，2002，12：1 106.

7 Zhang YP，Zhang X，Sun Y，et al.Apoptosis progression in the hair cells in the organ of corti of GJB2conditional knockout mice［J］.Clinical and Experimental Otorhinolaryngology，2012，5：1.