蠶蛹復(fù)合氨基酸對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 的抑制作用

湛孝東，施自倫，李朝品，*

1皖南醫(yī)學(xué)院，蕪湖241002;2 安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，淮南232001

蠶蛹營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，占鮮蛹的14%～15%，占干蛹的59.9%～66.2%［1］。蠶蛹蛋白水解后得到的復(fù)合氨基酸(CAASCP)含有人體生長發(fā)育所需的18 種氨基酸，其中8 種人體必需氨基酸含量高，用途十分廣泛［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蠶蛹復(fù)合氨基酸具有提高免疫機能作用［3］、減少脂肪合成［4］、保護肝臟作用［5］、營養(yǎng)保健促進創(chuàng)口愈合作用［6，7］及抗氧化和降血壓作用［8］，但蠶蛹復(fù)合氨基酸抗腫瘤作用報道極少。有研究表明蠶蛹復(fù)合氨基酸對S180、HepA 荷瘤小鼠的瘤體有明顯的抑制作用［9］。

肝細(xì)胞癌為常見腫瘤，死亡率高，生存期短，多數(shù)患者就診時已進入晚期，不宜手術(shù)切除。探討有效的藥物治療手段十分必要。腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已成為治療腫瘤的熱點和關(guān)鍵。本實驗選用人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，觀察蠶蛹復(fù)合氨基酸對其抑制作用及在體外誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HepG2 凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶蛹復(fù)合氨基酸(由湖州新天絲生物技術(shù)有限公司提供);人正常肝細(xì)胞株QSG-7701(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心);人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心);RPMI-1640 培養(yǎng)液(上海鈺森生物技術(shù)有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物公司);噻唑藍(lán)(MTT)、Annexin V-FITC、碘化吡啶(PI)、Hoechst33258、二甲基亞砜(DMSO)、Triton X-100、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、RNA 酶(均購自Sigma 公司)。

1.2 儀器

IX71FL 研究級倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);Eipcs XL 型流式細(xì)胞儀(美國Bec km an-Coulter 公司);Anthos lucy2 酶標(biāo)儀(奧地利ANTHOS 公司);MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱(日本三洋電子有限公司);高速冷凍離心機(德國Eppendorf 公司);SW-CJ-2A 凈化工作臺(吳江市新長城空調(diào)凈化有限公司);ZD-9556 搖床(金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司);AE-20 電子分析天平(瑞士Metller 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 蠶蛹復(fù)合氨基酸對正常肝細(xì)胞株的藥物毒性實驗

取適量凍存人正常肝細(xì)胞QSG-7701 復(fù)蘇，放于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入RPMI-1640 培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)，在37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。每隔3d 傳代一次，傳至5 代后消化、收集對數(shù)生長期的QSG-7701 細(xì)胞，并調(diào)整濃度為4 ×104個/mL 的單細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h 待細(xì)胞貼壁后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入不同濃度蠶蛹復(fù)合氨基酸(100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001 mg/mL)的RPMI-1640 培養(yǎng)液，同時設(shè)立空白對照組(只加培養(yǎng)液)，細(xì)胞對照組(只加細(xì)胞和培養(yǎng)液)，每組設(shè)5 個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h 后，每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，150 μL/孔加入DMSO 溶液，室溫震蕩10 min。用酶標(biāo)儀測量吸光度(OD 值)，檢測波長為490 nm。計算細(xì)胞存活率和最大無毒濃度TC0。一般認(rèn)為在藥物作用下若細(xì)胞存活率＞95%，此藥物濃度即為TC0，對培養(yǎng)細(xì)胞無毒性，為藥物作用的安全濃度［9］。

1.3.2 蠶蛹復(fù)合氨基酸對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 的抑制作用

1.3.2.1 蠶蛹復(fù)合氨基酸對SMMC-7721 增殖的影響

按照藥物毒性實驗中的方法將人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 復(fù)蘇，實驗組加入不同濃度蠶蛹復(fù)合氨基酸，分別培養(yǎng)24、48、72 h 后檢測OD 值。計算細(xì)胞抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.2.2 細(xì)胞凋亡率檢測

將潔凈蓋玻片置于6 孔板內(nèi)，每孔接種5 ×105個/mL 的SMMC-7721 細(xì)胞懸液1 mL，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，使蓋玻片上鋪滿細(xì)胞達(dá)80%以上。實驗分組:對照組(給予RPMI-1640 培養(yǎng)液);不同氨基酸濃度組。分別加入2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄上清液，以冷PBS(pH 7.2)洗3 遍，用0.5 mL 甲醇/冰乙酸(3∶1)在4 ℃固定5 min，吸棄固定液后，以PBS 洗3 遍，室溫干燥后用Hoechst33258(10 mg/L)染色，室溫避光30 min，PBS 清洗，干燥，封片。熒光顯微鏡下觀察并拍照后計算細(xì)胞的凋亡率。同一處理組隨機選擇5 個觀察視野，每個視野計數(shù)100 個細(xì)胞，計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，并計算細(xì)胞凋亡率，取5 次結(jié)果的平均值。熒光顯微鏡下正常細(xì)胞核呈彌散均勻的熒光，凋亡細(xì)胞核呈團狀或碎塊狀致密濃染的強熒光。

1.3.2.3 流式細(xì)胞術(shù)測定蠶蛹復(fù)合氨基酸對肝癌細(xì)胞周期的影響

按細(xì)胞凋亡檢測的方法加藥培養(yǎng)、洗滌SMMC-7721 細(xì)胞后，離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4 ℃固定保存過夜。離心棄去固定液，3 mL PBS 重懸5 min。300 目的篩網(wǎng)過濾1 次，500～1000 rpm 離心5 min，棄去PBS。用0.5 mL PI 染液染色，室溫避光染色30 min。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。

1.3.2.4 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡

按細(xì)胞凋亡檢測的方法加藥培養(yǎng)、洗滌SMMC-7721 細(xì)胞后，用1 ×Binding Buffer 重懸，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1 ×106個/mL。取500 μL 細(xì)胞懸液于EP管中。加入5 μL AnnexinV-FITC 和10 μL PI，室溫下避光孵育30 min，1 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.5 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差來描述。兩樣本均數(shù)比較采用方差檢驗，選擇P ＜0.05 作為具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。IC50通過SPSS11.5 統(tǒng)計軟件算出。

2 結(jié)果

2.1 蠶蛹復(fù)合氨基酸對正常肝細(xì)胞株QSG-7701的藥物毒性實驗結(jié)果

不同濃度的蠶蛹復(fù)合氨基酸對正常肝細(xì)胞株QSG-7701 的毒性作用見表1。

表1 蠶蛹復(fù)合氨基酸對正常肝細(xì)胞株QSG-7701 的毒性作用Table 1 Cytotoxicity of CAASCP against QSG-7701 cell strain

從表1 可以看出，當(dāng)蠶蛹復(fù)合氨基酸的濃度為10 mg/mL 時，細(xì)胞存活率＞95%，即TC0=10 mg/mL，可以認(rèn)為蠶蛹復(fù)合氨基酸在此濃度下對正常肝細(xì)胞株QSG-7701 基本無毒性。因此實驗中蠶蛹復(fù)合氨基酸的濃度分別設(shè)為10、1、0.1、0. 01、0. 001 mg/mL。

2.2 MTT 法檢測蠶蛹復(fù)合氨基酸對SMMC-7721 增殖的影響

不同濃度蠶蛹復(fù)合氨基酸分別作用24 、48 、72 h 后對SMMC-7721 增殖的抑制率見表2。

表2 不同濃度蠶蛹復(fù)合氨基酸分別作用24 h、48 h、72 h 后對SMMC-7721 增殖的抑制率(%，±s)Table 2 Inhibition rates of SMMC-7721 cell strain with different concentrations of CAASCP after 24 h，48 h，72 h culturing (%，±s)

表2 不同濃度蠶蛹復(fù)合氨基酸分別作用24 h、48 h、72 h 后對SMMC-7721 增殖的抑制率(%，±s)Table 2 Inhibition rates of SMMC-7721 cell strain with different concentrations of CAASCP after 24 h，48 h，72 h culturing (%，±s)

注:與對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compare with cell group，* P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01.

組別Group劑量Concentration(mg/mL)24 h 48 h 72 h OD 值OD values抑制率Inhibition rates OD 值OD values抑制率Inhibition rates OD 值OD values抑制率Inhibition rates空白對照(Blank group - 0.102 ±0.011 - 0.105 ±0.059 - 0.107 ±0.011 -細(xì)胞對照(Cell group) - 0.569 ±0.044 - 1.087 ±0.048 - 1.205 ±0.034 -藥物組Drug group 0.001 0.527 ±0.021 9.0 0.965 ±0.031＊＊ 12.4 1.021 ±0.032＊＊ 16.8 0.01 0.504 ±0.018* 13.9 0.916 ±0.057＊＊ 17.4 0.945 ±0.032＊＊ 23.7 0.1 0.468 ±0.023＊＊ 21.6 0.799 ±0.034＊＊ 29.3 0.804 ±0.022＊＊ 36.5 1 0.357 ±0.030＊＊ 45.4 0.594 ±0.025＊＊ 50.2 0.562 ±0.044＊＊ 58.6 10 0.319 ±0.039＊＊ 53.5 0.464 ±0.031＊＊ 63.4 0.432 ±0.025＊＊70.4

由表2 可得出，不同濃度的蠶蛹復(fù)合氨基酸(10、1、0.1、0.01、0.001 mg/mL)作用SMMC-7721細(xì)胞24、48 h 和72 h 后，各用藥組的細(xì)胞生長抑制率分 別 為9. 0%～53. 5%、12. 4%～63. 4% 和16.8%～70.4%。蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸對SMMC-7721 細(xì)胞有較強的抑制作用，各組與細(xì)胞對照組相比，吸光度值的差異有顯著性(P ＜0.05)，同時顯示出對劑量和時間的依賴性，即在同一作用時間內(nèi)，藥物濃度增加，細(xì)胞生長抑制率增加;同一藥物濃度下，作用時間越長，細(xì)胞生長抑制率越高。作用24、48、72 h 后，蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸對SMMC-7721 細(xì)胞的IC50分別為4.691、1.469 和0.451 mg/mL。

2.3 細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果

不同濃度蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸作用SMMC-7721 細(xì)胞48 h，經(jīng)Hoechst33258 染色法對其進行染色后，熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖1。在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞核呈彌散、均勻熒光，壞死細(xì)胞不被Hoechst 染色。出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀藍(lán)色熒光及明顯核形態(tài)變化，如果見到3 個或3 個以上的DNA 熒光碎片被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。不同濃度蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸作用48 h 后SMMC-7721 細(xì)胞的凋亡率見表3。

圖1 不同濃度蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸作用SMMC-7721 后的染色結(jié)果Fig.1 Dyeing results of SMMC-7721 with different concentrations of CAASCP

表3 不同濃度蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸作用48 h 后SMMC-7721 細(xì)胞的凋亡率Table 3 Apoptosis rate of SMMC-7721 with different concentrations of CAASCP after 48 h culturing

正常對照組細(xì)胞凋亡率為2.33%;0.001 mg/mL 濃度組的細(xì)胞凋亡率為3.32%;0.01 mg/mL 濃度組的細(xì)胞凋亡率為6.73%;0.1 mg/mL 濃度組的細(xì)胞凋亡率為13.66%;1 mg/mL 濃度組的細(xì)胞凋亡率為22.89%;10 mg/mL 濃度組的細(xì)胞凋亡率為31.21%。隨著蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸濃度的不斷增大，細(xì)胞凋亡率亦不斷增大，且與細(xì)胞對照組相比，差異有顯著性。

2.4 蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸作用后SMMC-7721 細(xì)胞的周期變化

經(jīng)PI 染色后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸對肝癌細(xì)胞SMMC-7721 的細(xì)胞周期分布的影響，結(jié)果見表4。

表4 蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸對人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞周期分布的影響Table 4 Effect of CAASCP on cell cycle distribution of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cell strain

由表4 可得出，正常生長的細(xì)胞對照組G0/G1期、S 期和G2/M 期細(xì)胞所占比例分別為48. 6%、42.3%和9.1%。不同濃度蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸作用SMMC-7721 細(xì)胞48 h 后，各給藥組G0/G1期和S期細(xì)胞所占比例出現(xiàn)不同程度的降低，而G2/M 期細(xì)胞則出現(xiàn)不同程度的升高，其中以10 mg/mL 濃度組升高的最多，為42.1%。實驗表明蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸能夠?qū)⑷烁伟┘?xì)胞株SMMC-7721 細(xì)胞阻滯在細(xì)胞的G2/M 期，并能誘導(dǎo)其凋亡。

2.5 蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸作用后SMMC-7721 細(xì)胞的凋亡變化

不同濃度蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸作用SMMC-7721 細(xì)胞48 h 后，檢測細(xì)胞凋亡情況。用FlowJo 5.0 軟件分析流式細(xì)胞儀檢測的圖像，其中第一象限為壞死細(xì)胞，第二象限為晚期凋亡細(xì)胞，第三象限為活細(xì)胞，第四象限為早期凋亡細(xì)胞。結(jié)果見圖2。不同濃度蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸作用SMMC-7721 細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡和壞死率的變化見表5。

由圖2、表5 可見，細(xì)胞對照組的凋亡和壞死細(xì)胞占7%，0.001 mg/mL 濃度組的凋亡和壞死細(xì)胞占11.75%，0.01 mg/mL 濃度組的凋亡和壞死細(xì)胞占25.84%，0.1 mg/mL 濃度組的凋亡和壞死細(xì)胞占38.17%，1 mg/mL 濃度組的凋亡和壞死細(xì)胞占47.90%，10 mg/mL 濃度組的凋亡和壞死細(xì)胞占51.63%。隨著蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸濃度的增加，凋亡和壞死細(xì)胞占的比率也增大，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。結(jié)果表明，蠶蛹復(fù)合氨基酸在體外能夠明顯的促進SMMC-7721 細(xì)胞株的凋亡和壞死。

3 討論

本實驗選取正常肝臟細(xì)胞QSG-7701 為對照細(xì)胞，通過藥物毒性實驗篩選出對正常肝臟細(xì)胞基本無毒的蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸的濃度，用此濃度的蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸去體外作用于肝癌細(xì)胞SMMC-7721，以此來研究其在體外的抗肝癌細(xì)胞的作用。蠶蛹復(fù)合氨基酸在濃度低時對正常細(xì)胞具有營養(yǎng)作用，故避免了因為濃度過大而引起對正常肝臟細(xì)胞的損害，對肝癌細(xì)胞具有抑制作用的同時對正常細(xì)胞提供營養(yǎng)，促進其生長［10］。以上實驗表明，蠶蛹復(fù)合氨基酸對肝癌SMMC-7721 細(xì)胞株具有較強的抑制作用。

圖2 不同濃度蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸作用SMMC-7721 后的細(xì)胞凋亡和壞死情況Fig.2 Apoptosis images of SMMC-7721 with different concentrations of CAASCP

表5 不同濃度蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸作用SMMC-7721 后的細(xì)胞凋亡和壞死率的變化Table 5 The apoptosis and necrosis rates of SMMC-7721 cell strain with different concentrations of CAASCP

流式細(xì)胞儀是目前國際公認(rèn)的最客觀的凋亡檢測指標(biāo)之一，尤其在用于定量分析和細(xì)胞周期分析時更為有效［11］。細(xì)胞凋亡時，流式細(xì)胞檢測可呈現(xiàn)亞二倍體核型峰的特征，也就是說，用DNA 結(jié)合染料PI 嵌入重疊的DNA 中，流式儀檢測DNA 含量低于正常二倍體的細(xì)胞就是亞二倍體細(xì)胞，也就是凋亡細(xì)胞，因而在DNA 直方圖上凋亡細(xì)胞出現(xiàn)二倍體峰(G1細(xì)胞)的減少，G1峰左側(cè)出現(xiàn)亞二倍體細(xì)胞群的峰型(Sub-G1)［12］。在我們研究凋亡細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，蠶蛹復(fù)合氨基酸能阻滯肝癌細(xì)胞SMMC-7721 的細(xì)胞周期于G2/M 期，使G2/M 期細(xì)胞比例增加，而G0/G1期和S 期細(xì)胞比例下降，說明所制備的蠶蛹復(fù)合氨基酸溶液能夠?qū)⒏伟┘?xì)胞SMMC-7721 阻滯在細(xì)胞的G2/M 期，具有抑制肝癌細(xì)胞的功能并能誘導(dǎo)其凋亡，這與國內(nèi)學(xué)者的報道一致［13］。

本研究證實了蠶蛹復(fù)合氨基酸對肝癌SMMC-7721 細(xì)胞株具有一定的抑制作用，為蠶蛹復(fù)合氨基酸的藥效提供了理論支持，也為蠶蛹的綜合利用開辟了新途徑。但本研究只是在體外觀察了蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸對肝癌SMMC-7721 細(xì)胞株的抑制作用，還需體內(nèi)實驗的驗證。另外蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸的成分復(fù)雜，具體的抗癌成分也有待進一步分析。

1 Tomotake H，Katagiri M，Yamato M.Silkworm pupae (Bombyx mori )are new sources of high quality protein and lipid.J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo)，2010，56:446-448.

2 Wang YP(王彥平)，Liu J (劉潔)，Wu YM (吳予明)，et al. Analysis of nutrition composition on silkworm pupa. J Zhengzhou Univ (Med sci)，2009，44:638-641.

3 Chang YQ(昌友權(quán))，Qi YX(戚穎欣)，Sun XW(孫學(xué)偉)，et al.Research on effects of protein in silkworm chrysalis on immunological function of mice. Food Sci，2007，28:520-522.

4 Lee SH，Park D，Yang G，et al.Silk and silkworm pupa peptides suppress adipogenesis in preadipocytes and fat accumulation in rats fed a high-fat diet.Eur J Nutr，2012，51:1011-1019.

5 Deng LX(鄧連霞)，Shen XQ(沈新琦)，Zhu LY(朱良均)，et al. New research on application of silkworm pupa. Bull Sericulture，2011，41(3):10-13.

6 Pu JB(浦錦寶)，Zhu YQ(祝永強)，Zheng JX(鄭軍獻(xiàn))，et al.Nourishing and concreting effects of co-amino acids extracted from silkworm chrysalis on surgical hurt rats. Chin J Clin Pharmacol Ther，2004，9:811-814.

7 Pu JB(浦錦寶)，Ji CL(季春蓮)，Wei LX(魏凌秀)，et al.The impact of co-amino acids extracted from silkworm chrysalis on the growth of juvenile male rats. Chin J Trad Medi Scie and Tech，2001，(8):371-372.

8 Zhao ZX(趙鐘興)，Liao DK(廖丹葵)，Sun JH(孫建華)，et al. Screening for optimal enzyme for preparation of silkworm pupae protein hydrolysate with in vitro antixodiant and antihypertensive activities and process optimization by response surface methodology.Food Sci，2011，32:186-191.

9 Lou JX(樓錦新). The pupa composite amino acids in the treatment of malignant tumors. Chin J Cancer，1995，4(5):29-29.

10 Pan XB，Zhu L，Gao Y，et al.Comparisons of the characteristics and mechanisms of HBV replication in QSG-7701 and HepG2 cell lines. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2007，15(2):83-87.

11 Chang Q，Hedley D.Emerging applications of flow cytometry in solid tumor biology.Methods，2012 Apr 6.(Epub ahead of print).

12 Lindstr?m S. Flow cytometry and microscopy as means of studying single cells:a short introductional overview.Methods Mol Biol，2012，853:13-15.

13 Hu DC(胡德聰)，Liu Q(劉瓊)，Wang H(王紅)，et al.Apoptosis of human hepatoma cells SMMC-7721 induced by selenium-abundant amino acids from silkworm pupa. Chin Pharmacol Bull，2004，20:1287-1292.