絞股藍(lán)多糖體外抗氧化活性研究

尚曉婭 ，張 媛，白艷玲，牛衛(wèi)寧，徐春蘭，欽傳光

西北工業(yè)大學(xué)，西安710072

絞股藍(lán)(Gynostemma pentaphyllum Makino)為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物，又稱七葉參、七葉膽、甘茶蔓［1，2］。目前，全世界已知絞股藍(lán)植物有13 種，我國(guó)占11 種，其中7 種為我國(guó)獨(dú)有，陜西安康、平利、洋縣、嵐皋等縣市進(jìn)行的絞股藍(lán)野生人工馴化栽培已成為我國(guó)絞股藍(lán)最大的人工栽植基地。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)多糖是絞股藍(lán)的有效活性成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血壓等諸多藥理作用［3，4］。Wang 等［5］研究了絞股藍(lán)粗多糖以及其三個(gè)均一組分的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)粗多糖比均一組分清除超氧自由基的能力更強(qiáng)，但是粗多糖和均一組分對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用未知。除此之外，精制多糖與粗多糖相比，其抗氧化活性是否更好?這些問(wèn)題均需要進(jìn)一步研究與探討。本文系統(tǒng)研究絞股藍(lán)粗多糖和精制多糖在體外對(duì)DPPH、羥自由基的清除能力、對(duì)小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化和Fe2+-H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用以及還原能力，以期為絞股藍(lán)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基礎(chǔ)闡明和功能食品開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絞股藍(lán)購(gòu)于陜西省平利縣絞股藍(lán)栽培基地，烘干備用。

D-葡萄糖(Glu)、D-甘露糖(Man)、D-阿拉伯糖(Ala)、D-半乳糖(Gal)、D-木糖(Xyl)、L-鼠李糖(Rha)、L-巖藻糖(Fuc)、D-核糖(Rib)、D-脫氧核糖(Deo)，美國(guó)Sigma 公司。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，美國(guó)Sigma公司;Tris-Base 0497 超級(jí)純，美國(guó)Amresco 公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氟乙酸(TCA)、三氯化鐵、甲醇、水楊酸、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、亞硝酸鈉、鎢酸鈉、氯化鈉、30%H2O2、乙醚、氯仿、正丁醇、無(wú)水乙醇、丙酮、鄰苯三酚、硫代巴比妥酸(TBA)、抗壞血酸(Vc)等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);U-3310 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本HITACHI 公司);6890 型氣相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司);DK-600S 型三用恒溫水箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);TG16A-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)，GL-22M 高速冷凍離心機(jī)(湖南塞特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 絞股藍(lán)粗多糖的制備

取200 g 干絞股藍(lán)，用95%乙醇在50 ℃回流提取3 次，去掉上清液，收集濾渣。將濾渣用蒸餾水在95 ℃提取2 次，每次1.5 h，收集提取液，離心，收集上清液。將上清液濃縮，加入4 倍體積的乙醇，4 ℃放置一整夜以沉淀多糖，離心，收集沉淀，分別用乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀，冷凍干燥，得到灰白色絞股藍(lán)粗多糖(GPMPP)粉末。

1.3.2 絞股藍(lán)精制多糖的制備

將10 g 粗多糖加蒸餾水復(fù)溶配成5%粗多糖溶液，加入1/5 體積Sevag 試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，劇烈震蕩，離心，取上清液，加1/5 體積Sevag 試劑，如此重復(fù)多次，直至無(wú)白色中間層沉淀。收集上清液濃縮，分別用自來(lái)水和蒸餾水透析，加入4 倍體積乙醇，4 ℃放置一整夜，離心，收集沉淀，分別用乙醇、丙酮和乙醚洗滌沉淀，冷凍干燥，得到白色絞股藍(lán)精制多糖(GPMP)粉末。

1.3.3 紫外光譜分析

取絞股藍(lán)精制多糖(GPMP)1 mg 左右，加適量水溶解，在波長(zhǎng)190～600 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以蒸餾水作為空白。

1.3.4 多糖中單糖組成成分分析

取5 mg 精制多糖樣品，加入1.5 mL 5 mol/L 三氟乙酸溶液，封管，100 ℃水解6 h，離心除去殘?jiān)?，減壓濃縮至干，用去離子水洗滌，減壓濃縮至干，重復(fù)5 次，除去殘留的三氟乙酸。

多糖水解物制成糖腈乙酸酯衍生物，進(jìn)行氣相色譜分析，色譜柱為石英毛細(xì)管柱DB-1701(30 m×0.25 mm ×0.25 μm)，程序升溫:110 ℃(3 min)～210 ℃(30 min)，20 ℃/min，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，N2流速:1.0 mL/min。

1.3.5 絞股藍(lán)多糖抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 總還原能力

參考Lin 等的方法［6］。0.4 mL 不同質(zhì)量濃度的粗多糖或精制多糖溶液與0.4 mL 0.2 mol/L 磷酸鈉緩沖液(pH 6.6)和0.4 mL 1%鐵氰化鉀混合，50 ℃孵育20 min，加入0.4 mL 10%三氯乙酸(w/v)，混和物在200 g 離心10 min，上清液(0.8 mL)與0.8 mL 去離子水，0.16 mL 0.1%三氯化鐵混合，在700 nm 處測(cè)吸光度。反應(yīng)后的生成物在700 nm 處的吸光度的大小即反映了其還原能力的大小。蒸餾水作陰性對(duì)照，Vc 作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.5.2 清除DPPH 自由基活性

參考Kong 等的方法［7］。不同質(zhì)量濃度的粗多糖或精制多糖溶液0.4 mL 與0.4 mL 0.2 mmol/L DPPH 甲醇溶液混合，混勻，避光放置30 min 后，用紫外分光光度計(jì)在517 nm 處測(cè)吸光度。蒸餾水作陰性對(duì)照，Vc 作陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算清除率:

樣品組:DPPH +測(cè)試樣品;對(duì)照組:DPPH +樣品溶劑

1.3.5.3 清除羥基自由基活性

參考Fenton 反應(yīng)體系模型［8］。采用固定時(shí)間反應(yīng)法，在相同反應(yīng)體積的反應(yīng)體系內(nèi)(8.8 mmol/L H2O20.2 mL，9 mmol/L FeSO40.2 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.2 mL)，加入不同質(zhì)量濃度的粗多糖或精制多糖溶液0.4 mL，在510 nm 處測(cè)吸光度A。蒸餾水作陰性對(duì)照，Vc 作陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算清除率:

1.3.5.4 抑制小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化作用

參考Ke 等的方法［9］。取2.5% 肝勻漿懸浮液2 mL，加入不同質(zhì)量濃度的粗多糖或精制多糖溶液0.4 mL，37 ℃水浴60 min，加入15% TCA 2 mL 終止反應(yīng)，再加入0.67% TBA 2 mL，于沸水浴中顯色15 min，冷卻后離心，取上清液于532 nm 處測(cè)吸光度A。蒸餾水作陰性對(duì)照，Vc 作陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算抑制率:

1.3.5.5 抑制Fe2+-H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化作用

參考Amaral 等的方法［10］。取2.5% 肝勻漿懸浮液1 mL，加入不同質(zhì)量濃度的粗多糖或精制多糖溶液0.4 mL，再加入6 mmol/L FeSO4溶液0.1 mL和60 mmol/L H2O240 μL，37 ℃水浴60 min，加入15% TCA 1 mL 終止反應(yīng)，再加入0. 67% TBA 1 mL，于沸水浴中顯色15 min，冷卻后離心，取上清液于532 nm 測(cè)吸光度A。蒸餾水作陰性對(duì)照，Vc 作陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算抑制率:

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜分析

GPMP 水溶液在波長(zhǎng)區(qū)段190 nm～400 nm 的紫外光譜掃描圖見(jiàn)圖1。從圖中可見(jiàn)，GPMP 在190 nm 處附近有最大吸收峰，其為多糖的特征吸收峰。核酸的特征吸收峰在260 nm 處，多肽、蛋白質(zhì)的特征吸收峰在280 nm 處，GPMP 在波長(zhǎng)260 nm 和280 nm 附近均沒(méi)有顯示明顯的吸收峰，表明GPMP 不含有核酸、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，純度較高。

圖1 GPMP 的紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of GPMP

2.2 絞股藍(lán)多糖單糖組成分析

圖2 是9 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖，9 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品按照保留時(shí)間不同，其出鋒順序依次為脫氧核糖(Deo)、鼠李糖(Rha)、核糖(Rib)、巖藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)。圖3 是絞股藍(lán)精制多糖GPMP 水解后的氣相色譜圖。對(duì)照單糖標(biāo)準(zhǔn)品在GC 上的保留時(shí)間和GPMP 水解后在GC 上的保留時(shí)間，可知GPMP 由鼠李糖(7. 43%)、阿拉伯糖(20.18%)、木糖(5.36%)、甘露糖(8.78%)、葡萄糖(26.71%)和半乳糖(31.54%)組成，物質(zhì)的量比為1.39∶3.76∶1.00∶1.64∶4.98∶5.88。其主要的單糖組分是半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖，其物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)達(dá)到78.43%。

2.3 抗氧化結(jié)果及分析

2.3.1 絞股藍(lán)多糖總還原力的測(cè)定

一般情況下，物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)，其抗氧化活性也越高。從圖4 可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，絞股藍(lán)粗多糖GPMPP 和精制多糖GPMP 還原力測(cè)試混合液的吸光度隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，并表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。GPMPP 的濃度為1 mg/mL 時(shí)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為0.642;濃度上升到5 mg/mL 時(shí)，對(duì)應(yīng)的吸光度值相應(yīng)增加到1. 618。而精制多糖GPMP 的還原能力明顯低于粗多糖，GPMP 的濃度為1 mg/mL 時(shí)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為0.148;濃度上升到5 mg/mL 時(shí)，對(duì)應(yīng)的吸光度值相應(yīng)增加到0. 513。絞股藍(lán)粗多糖的還原能力高于精制多糖，其原因可能是因?yàn)樵诔鞍椎倪^(guò)程中粗多糖的某些氫鍵斷裂造成多糖空間結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致精制多糖GPMP 的還原能力減弱。

圖4 絞股藍(lán)多糖的總還原力Fig.4 Reducing power of the polysaccharides from G.pentaphyllum Makino

2.3.2 絞股藍(lán)多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力

從圖5 可以看出，Vc 清除DPPH 自由基的能力非常強(qiáng)，在濃度為0.1 mg/mL 時(shí)，其清除率就已分別達(dá)到94.64%，濃度繼續(xù)增加幾乎達(dá)到100%。粗多糖GPMPP 對(duì)DPPH 自由基的清除率隨著多糖濃度的增加呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，并且濃度達(dá)到3 mg/mL 時(shí)逐漸趨于平衡，濃度大于3 mg/mL 時(shí)清除率增長(zhǎng)不明顯。精制多糖GPMP 對(duì)DPPH 自由基的清除率隨著多糖濃度的增加也呈明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，并且表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。當(dāng)GPMP 濃度為1 mg/mL 時(shí)其清除率僅為19.79%，而濃度為3 mg/mL 時(shí)清除率增加到44.42%，濃度再增加到5 mg/mL 時(shí)清除率高達(dá)63.41%。絞股藍(lán)粗多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力高于精制多糖，這與前面還原力的結(jié)果一致，除了上述原因，還有可能是因?yàn)榇侄嗵且褐谐嗵浅煞滞猓€有部分蛋白質(zhì)、色素等其他成分，而蛋白質(zhì)和色素有一定的清除DPPH 自由基的活性，因此在兩者協(xié)同作用下達(dá)到了較高的清除活性。

2.3.3 絞股藍(lán)多糖對(duì)羥自由基的清除能力

從圖6 可知，粗多糖GPMPP 和精制多糖GPMP對(duì)H2O2/Fe2+體系通過(guò)Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的·OH 都具有清除作用，且隨著多糖濃度的增加，清除率上升，當(dāng)濃度高于3 mg/mL 時(shí)，清除率上升緩慢，趨于平穩(wěn)。GPMPP 的濃度為1 mg/mL 時(shí)，其對(duì)·OH 的清除率接近50%;而GPMP 的濃度僅為0.5 mg/mL時(shí)，其對(duì)·OH 的清除率已達(dá)到50%，說(shuō)明在相同時(shí)間內(nèi)GPMP 對(duì)·OH 的清除作用比GPMPA 要強(qiáng)。從圖中我們還可以發(fā)現(xiàn)，精制多糖GPMP 對(duì)·OH的清除能力非常強(qiáng)，可與Vc 相抗衡。當(dāng)GPMP 濃度為1 mg/mL 時(shí)，此時(shí)對(duì)·OH 的清除率已超過(guò)80%，當(dāng)濃度達(dá)到5 mg/mL 時(shí)，清除率高達(dá)99%以上，比相同濃度的Vc 還要高?？赡芤?yàn)榫贫嗵荊PMP 的純度較高，其成分為多糖，不含有其他雜質(zhì)，而多糖在清除·OH 能力方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

2.3.4 絞股藍(lán)多糖對(duì)小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的作用

從圖7 可以看出，絞股藍(lán)多糖GPMPP 和GPMP各劑量對(duì)小鼠肝勻漿自氧化MDA 的形成有明顯的抑制作用，且隨添加劑量的增加，抑制效果較好。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，粗多糖GPMPP 的抑制率要明顯高于精制多糖GPMP，但是粗多糖在濃度達(dá)到3 mg/mL 以上時(shí)，其抑制率不再增加，而精制多糖的抑制率則隨著濃度的增大而明顯增加。粗多糖GPMPP在較高濃度時(shí)，其抑制率比Vc 要高，表明絞股藍(lán)多糖在抑制小鼠肝勻漿自氧化MDA 的形成方面具有很大的潛力。

圖7 絞股藍(lán)多糖對(duì)小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的作用Fig.7 Effects of the polysaccharides from G. pentaphyllum Makino on liver lipid peroxidation

2.3.5 絞股藍(lán)多糖對(duì)Fe2+-H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的作用

亞鐵離子和雙氧水是很強(qiáng)的自由基誘導(dǎo)劑，在小鼠肝勻漿中添加自由基誘導(dǎo)劑后其自氧化產(chǎn)生的MDA 量顯著增加。從圖8 可知，在這兩種物質(zhì)存在的體系下，絞股藍(lán)多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制MDA 生成活性。劑量為5 mg/mL 時(shí)，粗多糖和精制多糖的抑制率分別為49.35%和53.53%。表明絞股藍(lán)多糖可能是通過(guò)對(duì)自由基產(chǎn)生的抑制作用來(lái)抑制肝組織自氧化，從而達(dá)到保護(hù)肝組織的目的。

圖8 絞股藍(lán)多糖對(duì)Fe2+-H2O2 誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的作用Fig.8 Effects of the polysaccharides from G. pentaphyllum Makino on liver lipid peroxidation induced by Fe2+-H2O2

3 結(jié)論

對(duì)絞股藍(lán)粗多糖和精制多糖的研究表明，絞股藍(lán)多糖具有較好的還原能力，對(duì)DPPH 自由基和·OH 具有較強(qiáng)的清除能力，并且對(duì)小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化和Fe2+-H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化具有較好的抑制作用。與精制多糖GPMP 相比，粗多糖GPMPP 的還原能力、清除DPPH 自由基的能力以及對(duì)小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用更好;與粗多糖GPMPP 相比，精制多糖GPMP清除·OH 的能力以及對(duì)Fe2+-H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用更好。

絞股藍(lán)粗多糖在抑制小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化方面比Vc 要好，絞股藍(lán)精制多糖在清除·OH方面也能與Vc 抗衡，表明絞股藍(lán)多糖具有良好的抗氧化活性，具有開(kāi)發(fā)成天然抗氧化劑的潛力。

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