響應面法優(yōu)化細果角茴香中總黃酮的超聲提取條件

張秋龍，梁永欣，李文聰，索有瑞，丁晨旭* ，王洪論

1中國科學院西北高原生物研究所，西寧810001;2 中國科學院研究生院，北京100049;3 青海民族大學，西寧810007

藏藥角茴香(Hypecoum leptocarpum Hook. f. et Thoms)為罌粟科角茴香屬植物［1］，別名咽喉草、山黃連或野茴香等，藏藥名為巴爾哇打、巴爾巴達。生長于海拔4.300 km 以下的草原、草甸、砂礫地上［2］，味苦性涼，清血熱、溫熱和毒熱［3］。《西藏常用中草藥》稱其有解熱鎮(zhèn)痛、消炎解毒之功效，可治傷風感冒、頭痛、四肢關(guān)節(jié)疼痛、膽囊炎，并解食物中毒。《陜甘寧青中草藥選》中稱:細果角茴香能治流感、咽喉腫痛、目赤等癥?，F(xiàn)代分析化學和天然產(chǎn)物化學研究發(fā)現(xiàn):細果角茴香中含有多種生物堿成分，如:原阿片堿、隱品堿、血根堿等［4］。但國內(nèi)文獻關(guān)于細果角茴香中其它化學成分如總黃酮的含量研究尚少見報道，劉永紅等人［7］曾用甲醇為提取溶劑，采用正交法研究過提取工藝，本文用乙醇代替毒性較大的甲醇，采用超聲波輔助提取法［5，6］，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，使用響應面法［8，9］優(yōu)化細果角茴香中總黃酮的提取工藝，為細果角茴香的進一步研究開發(fā)提供更精確的科學依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細果角茴香:采收于青?；ブh北山，經(jīng)中科院西北高原生物研究所中藥學專家索有瑞研究員鑒定，自然風干，粉碎;蘆丁，購于北京生物醫(yī)藥公司;其它化學試劑均為分析純。

儀器:T6 新世紀紫外-可見分光光度計，北京譜析通用儀器有限責任公司生產(chǎn);KQ-500E 型超聲波清洗器(500W)，昆山市超聲儀器有限公司;N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司;AL204 電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SHZ-3 型循環(huán)水多用真空泵，上海亞榮生化儀器廠;DLSB-5/20 低溫冷卻循環(huán)泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準液的配制

精確稱取120 ℃干燥恒重的蘆丁標樣10 mg，用30%乙醇溶解并定容于50 mL 容量瓶中，搖勻，即得濃度為0.2 mg/mL 標準溶液。

1.2.2 吸收曲線繪制

準確移取蘆丁標液5.00 mL，按標準曲線下的測定方法，在450～600 nm 處測定吸收光譜，在510 nm 處有最大吸收，故選擇510 nm 為測定波長。

1.2.3 標準曲線繪制

分別移取蘆丁標準溶液0. 00、1. 00、2. 00、3.00、4.00、5.00 mL 于25 mL 容量瓶中，用30%乙醇稀釋至10 mL，加入1.0 mL5%NaNO2溶液搖勻，立刻加入1. 0 mL 10% Al(NO3)3搖勻，放置10 min。加入5 mL 1 mol/L NaOH 溶液，用30%乙醇定容，混合后搖勻，放置10 min，以試劑空白為參比，在510 nm 處測吸光度值。以蘆丁的濃度C(mg/mL)為橫坐標，以吸光度值A(chǔ) 為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為:A = 10. 39C-0. 0018，r =0.9991。

1.2.4 超聲提取

細果角茴香粉碎后過40 目篩，稱取1 g，加60%乙醇30 mL，浸泡15 min 后，在50 ℃下超聲30 min，抽濾。待樣品冷卻到室溫再進行下一次處理。合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，濃縮后用乙醇定溶于50 mL 容量瓶中備用。實驗分別考察了乙醇溶液濃度、液料比、提取溫度、超聲提取時間等因素對細果角茴香中總生物堿得率的影響。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度(A)、提取時間(B)、料液比(C)三個對總黃酮提取率影響較大的因素，對提取條件進行響應面分析，優(yōu)化提取工藝條件。

1.2.5 含量測定

吸取2 mL 濾液于25 mL 容量瓶中，按照標曲下的測定方法測吸光度，計算含量、得率。

1.2.6 單因素實驗

以乙醇為提取溶劑，主要考察乙醇溶液濃度、液料比、提取溫度、超聲提取時間等因素對細果角茴香中總生物堿得率的影響。

1.2.7 細果角茴香中總黃酮的提取工藝優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken 中心組合實驗設(shè)計原理，綜合單因素實驗結(jié)果，在50 ℃下以乙醇溶液為提取劑，選取對總黃酮影響較大的因素乙醇濃度(A)、提取時間(B)、液料比(C)，進行中心組合實驗，并結(jié)合單因素實驗條件選取合理水平。以總黃酮的得率為響應值，通過響應面分析得出超聲波提取細果角茴香中總黃酮的最佳提取工藝條件和方法。實驗設(shè)計因素編碼及水平見表1。

表1 中心組合設(shè)計因素與水平表Table 1 Factors and levels of the central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對細果角茴香總黃酮得率的影響

2.1.1 乙醇溶液濃度對細果角茴香中總黃酮提取率的影響。

固定提取時間30 min，提取溫度50 ℃，液料比30∶1，選擇乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%按照1.1.4 進行實驗。結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇溶液濃度對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

由圖1 可知，在乙醇濃度60%左右提取率最大，因此選擇乙醇濃度在60%左右為宜。

2.1.2 提取時間對細果角茴香中總黃酮提取率的影響

固定乙醇濃度60%，提取溫度50 ℃，液料比30∶1 mL/g，選擇超聲時間分別為20、25、30、35、40 min，按照1.1.4 進行實驗。結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時間對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

由圖2 可知，在10～30 min 內(nèi)，總黃酮的提取率隨著時間的延長而顯著增加，30 min 以后，總黃酮得率變化不大。為了節(jié)能超聲處理時間在30 min左右為宜。

2.1.3 料液比對總黃酮提取率的影響。

固定提取溫度50 ℃，乙醇濃度60%，提取時間30 min，選擇液料比分別為20、25、30、35、40，按照1.1.4 進行實驗。結(jié)果見圖3。

圖3 液料比對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ratio of liquid to solid on extraction yield of total flavonoids

由圖3 可知，當料液比達到30∶1 左右時，總黃酮基本溶出，再增加提取劑用量，提取率變化不大。因而，液料比30∶1 左右為宜。

2.1.4 溫度對總黃酮提取率的影響。

固定乙醇濃度60%，提取時間30 min，液料比為30∶1，選擇提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，按照1.1.4 進行實驗。結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of total flavonoids

由圖4 可知，總黃酮的提取率隨著溫度的提高而提高。溫度的升高會加強溶液中各分子的運動，促進擴散作用，有利于提高提取率，但溫度過高有可能破壞黃酮的結(jié)構(gòu)而降低其含量，故選擇提取溫度應為50 ℃。

2.2 響應面分析實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

利用DesignExpert8.0.7.1 軟件，通過表2 中總黃酮得率實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，對實驗結(jié)果進行響應面分析，得出回歸模型方差分析表和響應曲面圖，分別見表3 和圖5。

表2 Box-Behnken 中心組合設(shè)計方案及實驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiments design and the results of these experiments

120001.179 131011.409 140001.498 15-1-101.450 160001.363 171101.457

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

圖5 各兩因素交互作用對總生物堿提取率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots of mutual influences of extraction conditions on the extraction yields of total flavonoids

通過擬合可求出影響因素的一次效應、二次效應及其交互效應的關(guān)聯(lián)方程，多元回歸擬合分析得到細果角茴香總黃酮提取率Y 與各因素變量(A 乙醇濃度，B 提取時間，C 液料比)的二次方程模型為:Y = 1. 48-0. 024 × A + 0. 050 × B + 0. 13 × C +5.500E-003 ×A×B+ 4.500E-00 ×A ×C-0.036 ×B×C-0.055 ×A2-0.015 ×B2-0.081 ×C2

從表3 中方差分析結(jié)果可知方程一次項、二次項的影響均極顯著，說明分析結(jié)果可靠;從試驗所得的響應面分析結(jié)果可以找到它們在提取過程中的交互作用，如表3 和圖5 可知提取時間和液料比之間的交互作用顯著，其余項間的交互作用不明顯。根據(jù)Design Expert 8.0.7.1 軟件對實驗結(jié)果進行最優(yōu)化分析，確定最佳的提取條件為:乙醇濃度58%，提取時間34.55 min，液料比32.95 mL/g，在此條件下預測總黃酮的得率為1.538%。

2.3 驗證實驗

根據(jù)模型預測結(jié)果進行近似驗證實驗，但考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為乙醇濃度58%，提取時間34.50 min，液料比33 mL/g，在此條件下總黃酮提取率為1.525%(n=3)。

3 結(jié)論

用超聲法提取細果角茴香中總黃酮，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用Box-Behnken 試驗設(shè)計以及響應面分析對提取工藝進行優(yōu)化，得出最優(yōu)工藝條件為:乙醇濃度58%，提取時間34.50 min，液料比33 mL/g。在此工藝條件下，總黃酮提取率為1.525%(n =3)。該研究結(jié)果對細果角茴香中總黃酮的提取研究提供一定的參考價值，具有一定的實際應用前景。

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