響應面法超聲輔助提取優(yōu)化蛇床子素工藝的研究

陳 慧，李雪虎，陸錫宏，楊賢鵬，梁劍平*

1中國科學院近代物理研究所，蘭州730000;2 甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，蘭州730070

獨活(Radix Angelicae Pubescentis)為傘形科植物重齒毛當歸的干燥根［1］，主產(chǎn)于四川、湖北、安徽等地，是一種比較常見的中藥。主要有祛風除濕、通痹止痛等功效。據(jù)文獻報道，香豆素類化合物是獨活中所含的最主要活性成分，其中又以蛇床子素(Osthole)含量最高［2］，獨活具有抗炎鎮(zhèn)痛［3］、抗氧化［4］、抗血管生成作用［5］，其作用與蛇床子素成分密切相關(guān)。此外，還有揮發(fā)油、有機酸等［6］。獨活中蛇床子素由于具有較好的藥理活性受到了越來越多研究者的關(guān)注。目前，天然產(chǎn)物中有效成分的傳統(tǒng)提取方法有醇滲漉法、浸漬法、索氏抽提法和加熱回流法。但這些提取方法存在提取時間長、溶劑用量大、提取率低等問題。近年來，現(xiàn)代提取技術(shù)超聲提取法具有設備簡單、操作時間短、效率高等優(yōu)點，已廣泛用于提取天然產(chǎn)物中揮發(fā)油、苷類多糖、生物堿等有效成分［7］。經(jīng)查閱，前人［8，9］多采用單因子或正交實驗，實驗無法找到最佳因素水平組合。目前還未見采用響應面法超聲輔助提取獨活的報道，為此，本文以獨活為試驗材料，通過對獨活超聲波輔助提取過程中液料比(浸提液體積與獨活質(zhì)量的比值)、乙醇體積分數(shù)、提取時間以及提取溫度等因素與蛇床子素得率關(guān)系的研究，結(jié)合響應面法對蛇床子素提取工藝進行優(yōu)化篩選，旨在獲得最佳提取工藝，為獨活的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

獨活(西藏農(nóng)科院提供，由蘭州大學第二附屬醫(yī)院王曉飛博士鑒定);乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙醇、氯仿、氨水、鹽酸;去離子水，本實驗室自制;其余試劑均為分析純。蛇床子素(中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 儀器

高效液相色譜儀，美國Waterse2695;DFT-250手提式高速萬能粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司;KH-300DB 型數(shù)控超聲清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責任公司;Pine-tree 純水機，北京湘順源科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent EclipseXDB-C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(60∶40)，等度洗脫;體積流量1.0 mL/min;檢測波長322 nm;柱溫25 ℃;進樣體積10 μL;HPLC 色譜圖如圖1 所示。

圖1 蛇床子素標準品(a)和樣品(b)的HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard (a)and sample (b)

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取蛇床子素對照品7.4 mg，加甲醇制成含蛇床子素0.74 mg/mL 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取獨活干膏0.2 g，加入甲醇少量，超聲20 min 溶解后，放冷，濾過，置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.4 標準曲線的繪制

精密稱取蛇床子素對照品7.4 mg，加入甲醇使溶解并定容于10 mL 量瓶中，精確量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，于2 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻即得。用0.45 μm 微孔濾膜濾過后，分別進樣每個質(zhì)量濃度重復3 次，測定峰面積積分值。以蛇床子素質(zhì)量濃度對峰面積平均值進行線性回歸，得回歸方程Y =4E +07X +85203(R2=0.9993)在74.00～444.00 μg 與峰面積呈良好線性相關(guān)。

2.5 提取工藝流程

獨活→洗凈烘干→粉碎過篩→加入提取劑→超聲提取→減壓濃縮回收提取劑→0.3%鹽酸溶液溶解→過濾(氨水調(diào)pH 為9-11)→氯仿萃取→甲醇定容→計算粗品中蛇床子素含量

2.6 浸提條件的選擇

研究溫度(40、50、60、70、80 ℃)，乙醇溶液體積分數(shù)(55%、65%、75%、85%、95%)，料液比(10、15、20、25、30 mL/g)和提取時間(20、30、40、50、60 min)對獨活提取率的影響，首先做單因素實驗考察以上條件對提取率的影響，然后采用響應面分析法優(yōu)化最佳工藝條件。試驗均進行三次，取平均值。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 提取溫度對獨活中蛇床子素提取率的影響

在體積分數(shù)75%，提取時間為40 min，料液比為20 mL/g 的提取條件下，分別考察不同超聲溫度對蛇床子素提取，提取次數(shù)為3 次。超聲溫度對提取率的影響，如圖2 所示，隨著提取溫度的上升，蛇床子素提取率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，但溫度超過60℃，提取率反而下降。分析原因是:從較低溫度升至60 ℃，熱效率升高，分子運動加快，利于蛇床子素的破壁溶出;但隨著溫度的繼續(xù)升高，使部分蛋白凝固從而不利于蛇床子素溶出，故提取率下降，因此選擇提取溫度為60 ℃左右較為合適。

圖2 提取溫度對蛇床子素提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on the yield of osthole

3.1.2 乙醇體積分數(shù)對獨活中蛇床子素提取率的影響

在提取溫度60 ℃，超聲時間40 min，液料比20 mL/g 的提取條件下，分別用不同體積分數(shù)乙醇對獨活進行提取，提取次數(shù)為3 次。提取溶劑體積分數(shù)對提取率的影響，如圖3 所示。隨著乙醇體積分數(shù)的增大，蛇床子素提取率先增大后減小。這是因為乙醇對蛇床子素的溶解度比水大，乙醇對細胞的破壞作用比水強，在超聲波作用下表現(xiàn)得更加明顯。乙醇體積分數(shù)在75%時，獨活中的蛇床子素提取率較高，考慮到乙醇體積分數(shù)過高會增加生產(chǎn)成本。因此選取75%乙醇作為提取溶劑。

圖3 乙醇體積分數(shù)對蛇床子素提取率的影響Fig.3 Effect of percentage of ethanol on the yield of osthole

3.1.3 提取時間對獨活中蛇床子素提取率的影響

在乙醇體積分數(shù)75%，液料比20 mL/g，提取溫度60 ℃的提取條件下，分別用不同的超聲時間對獨活進行提取。提取時間對提取率的影響如圖4 所示由圖可知。隨著超聲作用時間的增加，獨活中蛇床子素的提取率迅速增大，可見提取時間越長，提取越充分。但時間超過40 min 后，蛇床子素提取率有所下降，因此選擇提取時間為40 min 左右較為合適。

圖4 提取時間對蛇床子素提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of osthole

3.1.4 料液比對獨活中蛇床子素提取率的影響

在提取溫度60 ℃，乙醇體積分數(shù)75%，超聲時間60 min 的提取條件下，分別用不同的料液比對獨活進行提取。料液比對提取率的影響如圖5 可知，隨著溶劑量的增加，蛇床子素含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當料液比低于1∶20 時，提取率隨著料液比的增大而升高，這是因為提取率的高低與蛇床子素向溶劑擴散的難易程度有關(guān)，料液比小，溶劑量少，導致兩相界面間的濃度差小，不利于蛇床子素的擴散。但當料液比高于1∶20 時，提取率變化不明顯，而且成本增加，不利用工業(yè)生產(chǎn)，因此最佳提取料液比為1∶20。

圖5 水料比對蛇床子素提取率的影響Fig.5 Effect of solvent/material ratio on the yield of osthole

3.1.5 提取次數(shù)對獨活中蛇床子素提取率的影響

以超聲溫度60 ℃，75%乙醇為溶劑，1∶20 料液比，40 min 超聲時間作為條件考查不同提取次數(shù)對獨活中蛇床子素提取率的影響。如圖6 所示，隨著提取次數(shù)的增加提取率逐漸增大，在提取次數(shù)到大3 時，提取率趨于穩(wěn)定，但隨著提取次數(shù)的增加所耗費的溶劑和成本也急劇增加，綜合各種因素考慮本試驗選定提取3 次為宜，既減少后期濃縮的困難，又節(jié)省能耗。

圖6 提取次數(shù)對蛇床子素提取率的影響Fig.6 Effect of extraction times on the yield of osthole

3.2 四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設計

3.2.1 蛇床子素提取率回歸方程的建立與檢驗

為了確定在多因素條件下超聲波提取蛇床子素的最佳工藝，本文在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇合適的參數(shù)范圍，對提取溫度、乙醇體積分數(shù)、提取時間、液料比4 個因素進行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計試驗，以蛇床子素的提取率為評價指標，優(yōu)化蛇床子素的最佳提取工藝，試驗自變量因素編碼及水平見表1。

表1 實驗因素水平表及編碼Table 1 Code and level of factors chosen for the trials

利用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計試驗，試驗方案及試驗結(jié)果見表2。

表2 響應面分析實驗設計及實驗結(jié)果Table 2 Design and experimental result of research surface methodology

2500000.959 2700000.978 2800000.985 2900000.987 3000000.969

根據(jù)表2 的結(jié)果，應用Design-Expert 7.0.0 軟件進行編程計算，通過其響應面回歸(RSREG)程序進行數(shù)據(jù)分析，得出回歸模型，回歸方程為:Y=0.98+ 0.019X1-0.0017X2+ 0.023X3+ 0.016X4-0.011X1X2-0. 00288X1X3-0. 00338X1X4-0.00388X2X3-0. 014X2X4-0.013X3X4-0.02X-0.03X-0.02X-0.037X。

表3 回歸模型統(tǒng)計分析結(jié)果Table 3 Results of statistical analysis for regression coefficients of model

由表3 回歸方差顯著性檢驗表明，一次項超聲提取溫度、時間對蛇床子素得率的線性效應極顯著，料液比對蛇床子素得率的線性效應顯著;二次項超聲提取溫度、乙醇濃度、時間、料液比對蛇床子素提取率的曲面效應極顯著;比較各因子間交互作用不顯著。在本實驗設計范圍內(nèi)回歸方程顯著性檢測P=0.01，極顯著，模型的確定系數(shù)為0.8981，說明該模型能解釋89.81%響應值的變化，即該模型與實際實驗擬合良好，試驗誤差小，回歸方程失擬檢驗不顯著，表明未知因素對試驗結(jié)果干擾很小。在本實驗中溫度和時間是影響蛇床子素提取最重要的兩個因素，在適當?shù)臏囟群蜁r間的條件下，提取蛇床子素能達到最大值，且X1(溫度)＞X3(時間)＞X4(料液比)＞X2(乙醇體積分數(shù));同時可以看出，各因素交互作用都不顯著。通過得出的模型，得到的最優(yōu)條件。最優(yōu)條件下即提取溫度為64.63 ℃，乙醇體積分數(shù)為73.18%，提取時間為45.33 min，料液比為20.67 mL/g。

3.2.2 響應面分析

圖7 是通過多元回歸方程所做的響應曲面圖及其等高線圖，所擬合的響應曲面和等高線圖能比較直觀地反映各因素和各因素間的交互作用。等高線圖直觀地反映出各因素交互作用對響應值的影響，橢圓形反映了兩因素的交互作用較強，而圓形則相反，由圖7 可以看出，6 個響應曲面均為開口向下的凸形曲面，隨著每個因素的增大，響應值增大;當響應值增大到極值后，隨著因素的增大，響應值逐漸減小;比較6 組圖及數(shù)據(jù)可得出X1、X2、X3、X4及各因素之間的交互作用對蛇床子素提取率的影響。從圖7a 中可以看出，固定提取時間40 min、液料比20 mL/g 的水平下，蛇床子素含量隨著乙醇體積分數(shù)及提取溫度的加大而急劇增加，表現(xiàn)為等高線更為陡峭;且乙醇體積分數(shù)對蛇床子素含量的影響較提取時間明顯。而當體積分數(shù)超過75%，提取溫度超過60 ℃時，蛇床子素含量增加變緩，等高線形狀逐漸向橢圓形發(fā)展，這說明乙醇體積分數(shù)與提取溫度之間有較強的交互作用。從圖7b 可以看出，固定體積分數(shù)75%、液料比20 mL/g 的水平下，開始蛇床子素隨著提取時間與提取溫度的增加而增加，但當提取溫度超過60 ℃，提取時間超45 min 后，蛇床子素含量增加緩慢，而且等高線也逐漸呈現(xiàn)橢圓形狀，這說明在蛇床子素含量緩慢達到最高值后仍有下降趨勢。這充分表明提取時間與提取溫度兩個因素的有一定交互作用。從圖7c 中可看出，等高線呈現(xiàn)明顯橢圓形，這表明在固定乙醇體積分數(shù)75%，提取時間45 min 水平下，蛇床子素含量隨著提取溫度及料液比的加大而急劇增加，表現(xiàn)為等高線更為陡峭;料液比對蛇床子素含量的影響較提取溫度明顯。這說明料液比與提取溫度之間有較強的交互作用。從圖7 d 中看出，等高線呈現(xiàn)橢圓形不是很明顯，在固定提取溫度60 ℃、液料比20 mL/g 的水平下，蛇床子素含量隨著提取時間的延長和乙醇體積分數(shù)的升高而增加，當提取時間超過45 min，同時乙醇的體積分數(shù)超過75%后。等高線變化比較平滑，可知提取時間與體積分數(shù)的交互作用不明顯。從圖7e 中可以看出，當固定提取時間45 min、提取溫度60 ℃水平下，蛇床子素含量隨著液料比的增大而先增加，然后又有降低的趨勢，從而表現(xiàn)為單位時間內(nèi)蛇床子素含量相對下降。另等高線形狀也逐漸呈現(xiàn)橢圓形狀，變化比較陡，得知體積分數(shù)和液料比之間有顯著性交互作用。圖7f 中的等高線形狀呈圓形，提取時間與液料比的有著顯著的交互作用。通過響應曲面交互作用分析，可發(fā)現(xiàn)各因素之間的交互作用對蛇床子素含量有重要影響。

3.2.3 驗證實驗

結(jié)合實際操作，把最優(yōu)條件調(diào)整為溫度為65℃，乙醇體積分數(shù)75%，提取時間為45 min，料液比為20 mL/g。并在此調(diào)整的最優(yōu)條件下平行提取3次，得到提取率分別為0.964%、0.978%、0.986%取平均值0.976%。經(jīng)測定，此值與理論值的誤差為0.011%，即RSD =0.011%，說明模型能較好的預測實際提取率。

4 討論

單因素實驗結(jié)果表明，蛇床子素的提取率的趨勢隨著提取溫度升高，乙醇濃度的增大，提取時間延長及料液比升高的增大而增大;而隨著提取時間延長及料液比的增加，蛇床子素提取率的趨勢是先增大后減小;提取次數(shù)為3 次時，獨活中的蛇床子素幾乎可以被提取完全。

響應面實驗結(jié)果表明，溫度、時間對實驗結(jié)果有極顯著的影響，乙醇體積分數(shù)對實驗結(jié)果有顯著影響，而料液比對實驗結(jié)果影響不顯著;得到的回歸方程Y=0.98+0.019X1-0.0017X2+0.023X3+0.016X4-0.011X1X2-0.00288X1X3-0.00338X1X4-0.00388X2X3-0.014X2X4-0.013X3X4-0.02X-0.03X22-0.02X-0.037X

圖7 因素之間的響應曲面及等高線圖Fig.7 RSM and contour line plots between different experimental factors

應用響應面分析法，確定超聲提取蛇床子素的最優(yōu)條件為:提取溫度64.63 ℃，乙醇體積分數(shù)為73.18%，提取時間45.33 min，料液比為20.67 mL/g;但從實際的操作考慮，調(diào)整為提取溫度為65 ℃，乙醇體積分數(shù)為75%，提取時間為45 min，料液比為20 mL/g。用上述實際的最佳條件進行提取，測得蛇床子素的提取率為0. 976%，相對標準誤差RSD=0.011%，所建立的模型能較好的預測超聲提取的實際提取率。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission (國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國藥典). Beijing:China Medical Science Press，2010.11.

2 Zhang GX(張恭孝)，Li JC(李聚倉)，Wang DC(王德才).Content determination of total coumarins in Radix Angelicae Pubescentis.Chin Arch Tradit Chin Med (中華中醫(yī)藥學刊)，2010，28:2647-2648.

3 Song JD(宋京都)，Wang W(王巍)，Yao SX(姚世霞)，et al.Study on analgesia and anti-inflammatory effects of three breeds of Radix Angelicae Pubescentis from Gansu province.Res Prac Chin Med(現(xiàn)代中藥研究與實踐)，2006，20:33-34.

4 Lu YC(盧永昌)，Zhang XM(張雪梅).Study on antioxidant effects on Grease about Radix Angelicae Pubesentis. J Qinghai Coll，Edu Sci(青海師專學報，教育科學)，2004，5:74-76.

5 Zou X(鄒璽)，Wang RP(王瑞平)，Dai H(戴虹)，et al.Anti-angiogenesis effect study of Radix Angelicae Pubesentis.J Nanjing TCM Univ (南京中醫(yī)藥大學學報)，2008，24:194-196.

6 Zhou G(周剛)，Ma BH(馬寶花).The development on the study of Radix Angelicae Pubescentis.China Mod Med (中國當代醫(yī)藥)，2012，19(16):15-16.

7 Wu FN(鄔方寧). Application of ultrasonic extraction in modern medicine.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2007，38:315-316.

8 Nie SM(聶詩明)，Yang CJ(楊昌娟).Study on the extraction technology of Radix Angelicae Pubescentis by orthogonal experimental design.Hubei J Tradit Chin Med (湖北中醫(yī)雜志)，2004，26(9):51-52.

9 Guo XR(郭新榮)，Zhang QH(張秋紅)，Zhu ZH(朱子徽)，et al.Research on ultrasound-assisted extraction optimization of total coumarins of Radix Angelicae Pubescentis. J Med Pharm Chin Minorities(中國民族醫(yī)藥雜志)，2011，8:57-59.