馬胎盤提取物對淋巴細胞的免疫調節(jié)作用

王曉然，高曉黎* ，王春梅，羅 俊，徐智勇

1新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊830011;2 新疆新姿源生物制藥有限責任公司，伊犁835801

胎盤是維持胎兒在母體內生長發(fā)育的臨時器官，《本草綱目》記載其具有“安神養(yǎng)血、補氣、益精、解毒、補血”的功效。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胎盤含有多種蛋白質、多肽、多糖、礦物質元素及維生素等，具有調節(jié)免疫功能［1］、抗氧化延緩衰老［2］、預防腫瘤、促進傷口愈合［3］、增強記憶力等保健功效。但是有關馬胎盤的研究仍處于起步階段，關于馬胎盤的相關研究作者幾乎未見國內文獻報道，本實驗旨在研究馬胎盤提取物的免疫調節(jié)作用，為馬胎盤的開發(fā)應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

刀豆蛋白ConA、脂多糖LPS、四甲基偶氮唑鹽MTT(美國Sigma 公司);DMEM 培養(yǎng)基、新生胎牛血清(Hyclone 公司);Formanzan 溶解液(武漢博士德生物工程有限公司);人前列腺癌PC-3 細胞(購自上海中科院細胞庫);昆明種小鼠(體重18～22 g，購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心);馬胎盤(由新疆新姿源生物制藥有限公司提供)。

3131 型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Termo Electron Corporation 公司);SB-JS-2 型潔凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);Xmark 型酶標儀(Bio-RAD 公司);CKX41 型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司);SC-3610 型低速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);Allegra 64R 低溫高速離心機(美國BECKMAN 公司);DRC-1100REG、FDU-2100 型冷凍干燥機(日本東京理化EYELA 公司);高速組織搗碎機(上海標本模型廠);S433D 型氨基酸分析儀(德國sykam 公司);96 孔細胞培養(yǎng)板、25 cm2細胞培養(yǎng)瓶(丹麥NUNC 公司)。

1.2 馬胎盤提取物的制備

取適量新鮮馬胎盤洗凈，剪碎至1 cm3小塊，按料液比1∶3(w/v)加入0.01 M 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)，組織勻漿(12000 rpm)。30 ℃靜置提取1 h，低溫高速離心(12000 rpm、15 min、4 ℃)收集上清液，透析，冷凍干燥得棕褐色粉末，4 ℃密封保存，臨用前用基礎DMEM 培養(yǎng)基溶解經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌。

1.3 淋巴細胞增殖活性實驗［4］

脫頸處死小鼠，無菌制備小鼠脾淋巴細胞懸液，調節(jié)細胞密度為1.8 ×107/mL，并用臺盼藍染色檢測細胞活力＞95%。在96 孔平底細胞培養(yǎng)板中，每孔分別加入淋巴細胞懸液150 μL。在EPE 對正常淋巴細胞活性影響的實驗中，設空白調零組、陰性對照組、EPE 組;在EPE 對ConA 誘導的T 淋巴細胞增殖活性影響的實驗中，設空白調零組、陰性對照組、ConA 對照組、ConA+EPE 組;在EPE 對LPS 誘導的B 淋巴細胞增殖活性影響的實驗中，設空白調零組、陰性對照組、LPS 對照組、LPS +EPE 組。每組均設5 個復孔。ConA 終濃度為10 μg/mL;LPS 終濃度為15 μg/mL;EPE 終濃度分別為1500、750、375、187.5、93.75、46.87、23.44 μg/mL。37 ℃、5%CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)68 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，板式離心機1200 ×g 離心15 min，吸棄上清120 μL，加入100 μL Formanzan 溶解液，過夜孵育，以空白對照孔調零，酶標儀570 nm 波長處測定各孔A 值。

1.4 NK 細胞殺傷活性實驗［5］

小鼠脾淋巴細胞的制備同1.3 項的方法，取對數(shù)生長期的人前列腺癌細胞(PC-3)為靶細胞，調整細胞密度為2.5 ×105/mL，在96 孔平底細胞培養(yǎng)板中接種100 μL，培養(yǎng)4 h 后，按效靶比50∶1 加入淋巴細胞(NK 細胞為效應細胞)，加入不同濃度EPE(終濃度分別為1500、375、93.75、23.44 μg/mL)，同時設立空白調零組、靶細胞對照組、效靶細胞對照組，靶細胞+EPE(終濃度同上)對照組，每組均設5個復孔。37 ℃、5% CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h 后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS 洗滌3 次，加入基礎DMEM 培養(yǎng)基200 μL，每孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基然后加入150 μL Formanzan 溶解液，過夜孵育，以空白對照孔調零，酶標儀570 nm 波長處測定各孔A 值，并計算NK 細胞殺傷活性:NK 細胞殺傷活性% =(1-實驗組A 平均值/靶細胞A 平均值)×100%。

1.5 EPE 氨基酸含量測定

采用GB/T 5009.124-2003 法，由農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗測試中心(烏魯木齊)檢測。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標準差(x ± s)表示，采用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，各組均數(shù)之間比較采用One-way ANOVA 檢驗。

2 結果與分析

2.1 EPE 對正常淋巴細胞活性的影響

與陰性對照組比較，低濃度EPE(93.75 μg/mL以下)對正常淋巴細胞的活性沒有明顯影響(P ＞0.05);隨著EPE 濃度逐漸增大(187.5～750 μg/mL)，對正常淋巴細胞的活性產(chǎn)生了明顯的增殖影響(P ＜0.01)，且EPE 濃度為187.5 μg/mL 時，增殖作用最明顯(126.3 ±5.4%);但繼續(xù)增大EPE 的濃度時(1500 μg/mL)，對正常淋巴細胞的活性產(chǎn)生了明顯毒性抑制作用(P ＜0.01)，見表1。

表1 不同濃度EPE 對正常淋巴細胞活性的影響(n=5，±s)Table 1 Direct effect of different concentrations of EPE on the normal lymphocytes (n=5，±s)

注:與對照組比較，1)P ＜0.01。Note:vs control group，1)P ＜0.01.

組別Group濃度Concentrations(μg/mL)A570細胞活力Cell viability(%)對照組Control00.887 ±0.013100.0 ±1.5 EPE15000.776 ±0.0221) 87.5 ±2.51)7501.010 ±0.0181) 113.9 ±2.01)3750.984 ±0.0291) 111.0 ±3.31)187.51.120 ±0.0481) 126.3 ±5.41)93.750.889 ±0.015100.2 ±1.7 46.870.888 ±0.008100.1 ±0.9 23.440.872 ±0.02298.4 ±2.5

2.2 EPE 對ConA 誘導的T 淋巴細胞增殖活性的影響

與ConA 對照組比較，不同濃度的EPE 均能對ConA 誘導的T 淋巴細胞增殖活性產(chǎn)生明顯的抑制作用(P ＜0.01);且呈劑量依賴性，隨著EPE 濃度的增大，增殖活性的抑制作用逐漸增大;當EPE 濃度最大時(1500 μg/mL)，增殖活性的抑制作用最強，但細胞活力已明顯低于陰性對照組(72. 1 ±3.8%)，見表2。

表2 不同濃度EPE 對ConA 誘導的T 淋巴細胞增殖活性的影響(n=5，±s)Table 2 Effect of different concentrations of EPE on the proliferation of T lymphocytes stimulated by ConA (n=5，±s)

表2 不同濃度EPE 對ConA 誘導的T 淋巴細胞增殖活性的影響(n=5，±s)Table 2 Effect of different concentrations of EPE on the proliferation of T lymphocytes stimulated by ConA (n=5，±s)

注:與對照組比較，1)P ＜0.01;與ConA 對照組比較，2)P ＜0.01。Note:vs control group，1)P ＜0.01;vs ConA control group，2)P ＜0.01.

組別Group ConA 濃度Concentrations of ConA(μg/mL)EPE 濃度Concentrations of EPE(μg/mL)A570細胞活力Cell viability(%)對照組Control 00.672 ±0.026 100.0 ±3.9 ConA1000.873 ±0.0111)129.9 ±1.61)1015000.485 ±0.0252)72.1 ±3.82)7500.725 ±0.0272)107.9 ±4.02)3750.765 ±0.0212)113.8 ±3.12)187.50.792 ±0.0242)117.8 ±3.62)EPE+ConA93.750.814 ±0.0162)121.1 ±2.32)46.870.820 ±0.0302)122.0 ±4.52)23.440.807 ±0.0222)120.1 ±3.32)0

2.3 EPE 對LPS 誘導的B 淋巴細胞增殖活性的影響

與LPS 對照組比較，僅兩個高濃度的EPE 組(750、1500 μg/mL)對LPS 誘導的B 淋巴細胞增殖活性產(chǎn)生了明顯的抑制作用(P ＜0.01)，見表3。

表3 不同濃度EPE 對LPS 誘導的B 淋巴細胞增殖活性的影響(n=5，±s)Table 3 Effect of different concentrations of EPE on the proliferation of B lymphocytes stimulated by LPS (n =5，±s)

表3 不同濃度EPE 對LPS 誘導的B 淋巴細胞增殖活性的影響(n=5，±s)Table 3 Effect of different concentrations of EPE on the proliferation of B lymphocytes stimulated by LPS (n =5，±s)

組別Group LPS 濃度Concentrations of LPS(μg/mL)EPE 濃度Concentrations of EPE(μg/mL)A570細胞活力Cell viability(%)00.662 ±0.047 100.0 ±7.0 LPS1501.016 ±0.0151)153.4 ±2.21)1515000.712 ±0.0412)107.4 ±6.12)7500.889 ±0.0162)134.3 ±2.42)3750.984 ±0.018 148.5 ±2.7 EPE+LPS187.51.001 ±0.022 151.1 ±3.4對照組Control 0

注:與對照組比較，1)P ＜0.01;與LPS 對照組比較，2)P ＜0.01。Note:vs control group，1)P ＜0.01;vs LPS control group，2)P ＜0.01.

2.4 EPE 對NK 細胞殺傷活性的影響

EPE 與PC-3 細胞單獨作用，與PC-3 對照組比較，僅有高濃度EPE(1500 μg/mL)對PC-3 細胞活性產(chǎn)生了明顯的抑制作用(P ＜0.01);其他濃度對PC-3 細胞活性無明顯影響(P ＞0.05)，見表4。

表4 不同濃度EPE 對PC-3 細胞的直接作用(n=5，±s)Table 4 Direct effect of different concentrations of EPE on the PC-3 cells (n=5，±s)

表4 不同濃度EPE 對PC-3 細胞的直接作用(n=5，±s)Table 4 Direct effect of different concentrations of EPE on the PC-3 cells (n=5，±s)

注:與對照組比較，1)P ＜0.01。Note:vs control group，1)P ＜0.01.

組別Group EPE 濃度Concentrations of EPE(μg/mL)A570細胞活力Cell viability(%)對照組Control01.713 ±0.079100.0 ±6.2 15001.317 ±0.0631) 68.6 ±5.01)3751.645 ±0.06494.6 ±5.0 EPE93.751.686 ±0.08397.9 ±6.6 23.441.711 ±0.06499.8 ±5.1

EPE 與NK 細胞和PC-3 細胞共同作用，與效靶細胞對照組比較，不同濃度的EPE 均能明顯增強NK 細胞對PC-3 細胞的殺傷活性(P ＜0.01);且呈劑量依賴性，隨著EPE 濃度的增大，殺傷活性逐漸增強;當EPE 濃度最大時(1500 μg/mL)，殺傷活性的最強(44.4 ±2.8%)，其次為375 μg/mL 組(30.1±4.3%)和93.75 μg/mL 組(25.3 ±6.4%)，見表5。

表5 不同濃度EPE 對NK 細胞殺傷PC-3 細胞活性的影響(n=5，±s)Table 5 Effect of different concentrations of EPE on the cytotoxicity of NK cells against PC-3 cells (n=5，±s)

表5 不同濃度EPE 對NK 細胞殺傷PC-3 細胞活性的影響(n=5，±s)Table 5 Effect of different concentrations of EPE on the cytotoxicity of NK cells against PC-3 cells (n=5，±s)

組別Group EPE 濃度Concentrations of EPE(μg/mL)A570殺傷活性Cytotoxicity(%)靶細胞對照Target cell control 01.527 ±0.0520.0 ±3.4效靶細胞對照effector-target cell control 01.270 ±0.0611)16.8 ±4.01)15000.849 ±0.0422)44.4 ±2.82)3751.067 ±0.0662)30.1 ±4.32)EPE93.751.141 ±0.0972)25.3 ±6.42)

注:與靶細胞對照組比較，1)P ＜0.01;與效靶細胞對照組比較，2)P ＜0.01。Note:vs control group of target cells，1)P ＜0.01;vs control group of effector-target cells，2)P ＜0.01.

2.5 EPE 中氨基酸含量測定

EPE 中谷氨酸含量最高(7.53%)，其次為天門冬氨酸(5.64%)和亮氨酸(5.54%)，含有7 種必須氨基酸(色氨酸未測定)占氨基酸總量的38.9%。

表6 EPE 中氨基酸含量Table 6 Amino acid content of EPE

3 討論

本實驗研究顯示馬胎盤提取物(EPE)能一定程度增強正常淋巴細胞的活性，僅在最高濃度時(1500 μg/mL)表現(xiàn)出抑制正常淋巴細胞活性的作用，這可能是由于EPE 濃度過大對淋巴細胞產(chǎn)生了一定的毒性作用;不同濃度的EPE 對ConA 誘導的T 淋巴細胞增殖均具有顯著的抑制作用，且具有劑量依賴效應，而對于LPS 誘導的B 淋巴細胞增殖的抑制作用相對較弱，僅在EPE 濃度為1500、750 μg/mL 時有抑制效應。這表明EPE 的免疫抑制作用更傾向于T 細胞介導的細胞免疫，而對于B 細胞介導的體液免疫作用相對較弱［6］。

ConA、LPS 可分別作用于T、B 淋巴細胞膜表面的相應受體，分別刺激活化T、B 淋巴細胞進入細胞周期進行有絲分裂增殖反應。Lankoff 等研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞的增殖抑制作用可能與IL-2 分泌減少和IL-6 分泌增加有關［7］，且IL-2 的減少可能是由于IL-2mRNA 穩(wěn)定性的降低［8］，而B 淋巴細胞增殖的抑制作用可能與B 細胞抗原受體和線粒體途徑有關［9］。

EPE 單獨作用于PC-3 細胞，除了最高濃度(1500 μg/mL)對PC-3 細胞產(chǎn)生毒性作用抑制其活性外，其他濃度對PC-3 細胞活性均沒有明顯影響，說明EPE 并不能直接抑制PC-3 細胞的活性;而EPE 與NK 細胞聯(lián)合作用于PC-3 細胞，能明顯抑制其活性，且呈劑量依賴性，隨著EPE 濃度的增大，抑制率逐漸增大，說明EPE 能明顯增強NK 細胞對PC-3 細胞的殺傷活力。

NK 細胞殺傷活性無MHC 限制，不依賴抗體，有非特異性識別靶細胞的能力，活化的NK 細胞可合成釋放多種細胞因子，發(fā)揮調節(jié)免疫和直接殺傷靶細胞的作用。腫瘤細胞往往缺乏MHC-Ⅰ類分子的有效表達，故NK 細胞是腫瘤免疫治療中的重要部分，通過藥物增強NK 細胞活性繼而提高其對腫瘤細胞的殺傷作用是腫瘤免疫治療的重要研究方向［10］。

氨基酸含量分析結果表明EPE 中氨基酸含量豐富，且含有谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、天門冬氨酸等多種藥效氨基酸。

綜上所述，馬胎盤提取物(EPE)對免疫功能具有一定程度的調節(jié)作用，且自身毒性小，氨基酸營養(yǎng)豐富等特點。在免疫保健方面可能具有潛在的應用價值，其作用機制還有待進一步研究。

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