兩種中國南海海綿的化學(xué)成分和生物活性研究

賈 睿，郭躍偉 ，黃才國

1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306;2 中國科學(xué)院上海藥物研究所新藥研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203;3第二軍醫(yī)大學(xué)，上海200433

石海綿 (Petrosia sp.)屬于多孔動物門(Spongia)尋常海綿綱(Demospongiae)簡骨海綿目(Haplosclerida)磯海綿科(Renieridae)石海綿屬(Petrosia)動物。該屬海綿種類多樣，分布廣泛，且含有豐富的結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物。文獻(xiàn)報道石海綿(Petrosia sp.)屬的特征代謝產(chǎn)物是長鏈多烯多炔類化合物，還有少量的萜類和甾體［1］。含有氰基和異硫氰的沒藥烷型倍半萜多發(fā)現(xiàn)于海綿Theonella cf.swinhoei 和Halichondria sp.中，還未見從海綿Petrosia sp.中分離得到該類倍半萜的報道，且氰基和異硫氰及甲酰胺型多相伴而生，這暗示它們在生源上有密切的關(guān)系。由于樣品量的限制(粗提物287mg)，也可能是采集地和季節(jié)的差異，我們并沒有發(fā)現(xiàn)該屬特征的代謝產(chǎn)物-長鏈多烯多炔類化合物，但是我們從中首次分離得到四個倍半萜類化合物(1～4)和1 個芳香化合物(5)。

蜂海綿 (Haliclona sp.)屬于多孔動物門(Spongia)尋常海綿綱(Demospongiae)簡骨海綿目(Haplosclerida)蜂海綿科(Renieridae)蜂海綿屬(Haliclona)動物。該屬海綿含有豐富的代謝產(chǎn)物，也是被研究較多的一個屬。蜂海綿屬(Haliclona)典型的代謝產(chǎn)物是生物堿和甾體，還有少量的萜類和脂類［2］。我們從中分離得到兩個異喹啉型生物堿(6 和7)、4 個甾體(8～11)、2 個苷類(12 和13)、1 個三萜(14)及1 個芳香化合物(5)。其中化合物6 能有效抑制黃嘌呤氧化酶。

圖1 化合物1～14 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-14

1 儀器與材料

Bruker DRX-400 核磁共振儀，1H NMR 位移值以氘代溶劑中殘存的CHCl3(δ7.26 ppm)為內(nèi)標(biāo)，13C NMR 位移值以CDCl3(δ77.0 ppm)為內(nèi)標(biāo);Q-TOF Micro LC-MS-MS 質(zhì)譜儀(測定ESIMS);Finnigan-MAT-95 質(zhì)譜儀 (測定EI-MS);Sephadex LH-20(Amersham Pharmacia Biotech 生產(chǎn));柱層析硅膠(青島海洋化工分廠);TLC 預(yù)制板(煙臺匯友硅膠開發(fā)有限公司);石油醚(杭州煉油廠);正己烷(上海試劑一廠);丙酮(上海溶劑廠)。

實(shí)驗(yàn)樣品于2003 年1 月采自我國南海三亞海域水下20 m 處，立即冷凍備用。種屬由中國科學(xué)院海洋研究所李錦和研究員鑒定為石海綿(Petrosia sp.)和蜂海綿(Haliclona sp.);樣品標(biāo)本(LS-59和LS-77)保存在中國科學(xué)院上海藥物研究所海洋天然產(chǎn)物研究實(shí)驗(yàn)室。

2 提取與分離

石海綿(Petrosia sp.，干重14 g)切碎后用丙酮超聲提取3 次，將提取液減壓濃縮除去有機(jī)溶劑，濃縮物懸浮于30 mL 水中，用等體積的乙醚及正丁醇分別萃取4 次，有機(jī)相萃取液經(jīng)減壓濃縮分別得到乙醚粗浸膏113 mg 及正丁醇粗浸膏63 mg。正丁醇粗浸膏經(jīng)硅膠薄層層析檢測未發(fā)現(xiàn)感興趣的點(diǎn)，故舍棄。乙醚粗浸膏經(jīng)硅膠(200～300 目)柱層析，以石油醚-丙酮梯度洗脫(丙酮0～100%)，然后經(jīng)SephadexLH-20 凝膠柱層析，以石油醚/氯仿/甲醇(2∶1∶1)洗脫，然后經(jīng)硅膠(400～600 目)柱反復(fù)柱層析，分別得到5 個化合物:1 (3.2 mg)，2 (2.7 mg)，3 (4.1 mg)，4 (5.3 mg)和5 (6.6 mg)。

蜂海綿(Haliclona sp.，干重103 g)切碎后用丙酮超聲提取3 次，將提取液減壓濃縮除去有機(jī)溶劑，濃縮物懸浮于200 mL 水中，用等體積的乙醚及正丁醇分別萃取4 次，有機(jī)相萃取液經(jīng)減壓濃縮分別得到乙醚粗浸膏2.6 g 及正丁醇粗浸膏1.8 g。乙醚粗浸膏經(jīng)硅膠(200～300 目)柱層析，以石油醚-丙酮梯度洗脫(丙酮0～100%)，然后經(jīng)SephadexLH-20 凝膠柱層析，以石油醚/氯仿/甲醇(2∶1∶1)洗脫，然后經(jīng)硅膠(400～600 目)柱反復(fù)柱層析，分別得到7 個化合物:6 (23. 6 mg)，7 (4. 7 mg)，8 (136.1 mg)，9 (12.3 mg)，10 (10.7 mg)，11(19.2 mg)，14 (10.8 mg)。正丁醇粗浸膏經(jīng)凝膠柱層析和正相硅膠柱層析純化，得到2 個化合物:12(11.4 mg)，13 (9.6 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 無色油狀物，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 6.20 (1H，ddd，J = 15，10.8，1 Hz，H-9)，5.79 (1H，d，J = 10.8 Hz，H-8)，5.58 (1H，dd，J= 15，6.8 Hz，H-10)，2.33 (1H，m，H-11)，1.7(3H，br s，CH3-14)，1.42 (3H，t，J = 2 Hz，CH3-13)，0.99 (6H，d，J = 6.8 Hz，CH3-12，15);13C NMR (CDCl3，100 MHz):δ 26.3 (C-1，5)，38.1 (C-2，4)，56.6 (C-3)，44.6 (C-6)，138.4 (C-7)，123.7(C-8)，123.3 (C-9)，140.5 (C-10)，31.5 (C-11)，22.4 (C-12，15)，15.1 (C-14)，152.2 (C-16);ESIMS (m/z):231［M］+。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［3］對照基本一致，故鑒定化合物1 為3-isocyanotheonellin。

化合物2 無色油狀物，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ1.00 (6H，d，J = 6.6 Hz，CH3-12，15)，1.41(3H，s，CH3-13)，1.71 (3H，d，J = 1 Hz，CH3-14)，2.34 (1H，m，H-11)，5.56 (1H，dd，J = 15，6.6 Hz，H-10)，5.78 (1H，br d，J = 11 Hz，H-8)，6.21 (1H，ddq，J = 15，11，1 Hz，H-9);13C NMR (CDCl3，100 MHz):δ 15.2 (C-14)，38.1 (C-2，4)，56.6 (C-3)，44.6 (C-6)，138.7 (C-7)，123.9 (C-8)，123.4 (C-9)，140.6(C-10)，31.4 (C-11)，22.5 (C-12，15);ESI-MS (m/z):263［M］+。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］對照基本一致，故鑒定化合物2 為theonellin isothiocyanate。

化合物3 無色油狀物，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 1.00 (6H，d，J = 6.6 Hz，CH3-12，15)，1.42(3H，s，CH3-13)，1.72 (3H，s，CH3-14)，2.35(1H，m，H-11)，5.56 (1H，dd，J = 16，6.5 Hz，H-10)，5.79 (1H，br d，J = 11 Hz，H-8)，6.21 (1H，dd，J = 15，11 Hz，H-9);13C NMR (CDCl3，400 MHz):δ 140.7 (d)，139.2 (s)，123.7 (d)，123.4(d)，55.1 (s)，45.6 (d)，35.9 (t)，31.4 (t);ESIMS (m/z):222 ［M + H］+。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］對照基本一致，故鑒定化合物3 為theonellin amine。

化合物4 無色油狀物，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 1.00 (6H，d，J = 6.6 Hz，CH3-12，15)，1.35，1.42 (each 1/2H，s，H-13)，1.73 (3H，br s，CH3-14)，2.34 (1H，m，H-11)，5.59 (1H，dd，J =15，6.6 Hz，H-10)，5.81 (1H，br d，J = 11 Hz，H-8)，6.22 (1H，dd，J = 15，11 Hz，H-9)，8.04 (1/2H，d，J = 2.1 Hz，H-CHO)，8.31 (1/2H，d，J =12.3 Hz，H-CHO);13C NMR (CDCl3，100 MHz):δ 14.9 (C-14)，22.1，24.3 (each 1/2 C，C-13)，22.4(C-12，15)，27.2 (C-1，5)，31.2 (C-11)，36.7，39.0(each 1/2 C，C-2，4)，46.0，46.2 (each 1/2 C，C-3)，123.2 (C-8)，123.4 (C-9)，139.1，139.6 (each 1/2 C，C-7)，139.8，140.1 (each 1/2 C，C-10)，160.4，162.8 (each 1/2 C，C-CHO);EI-MS (m/z):249(M+)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］對照基本一致，故鑒定化合物4 為theonellin formamide。

化合物5 無色油狀物，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ7.7 (2H，ddd，J = 7.9，3.6，0.6 Hz，H-3，H-6)，7.5 (2H，m，H-4，H-5)，4.06 (4H，dd，J =6.6，0.6 Hz，H2-8，H2-8')，2.01 (2H，m，H-9，H-9')，0.96 (12H，dd，J = 6.8，0.7 Hz，CH3-10，CH3-11，CH3-10'，CH3-11')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5］對照基本一致，故鑒定化合物5 為鄰苯二甲酸二異丁酯。

化合物6 黃色粉末，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 8.94 (1H，d，J = 4.95 Hz，H-3)，7.92(1H，d，J = 7.92 Hz，H-4)，4.84 (1H，t，J = 4.81 Hz，H-OH)，5.19 (2H，d，J = 4.80 Hz，CH2-9)，4.15 (3H，s，OCH3-7)，2.10 (3H，s，CH3-6);13C NMR (CDCl3，100 MHz):δ 160.3 (C-1)，152.8 (C-3)，118.2 (C-4)，139.1 (C-4a)，184.5 (C-5)，121.7 (C-6)，158.2 (C-7)，181.6 (C-8)，130.7 (C-8a)，64.1 (C-9)，9.1 (C-CH3)，61.4 (C-OCH3);EI-MS (m/z):233 (M+)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］對照基本一致，故鑒定化合物6 為renierol。

化合物7 黃色粉末，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 8.26 (1H，s，H-1)，7.11 (1H，s，H-4)，4.17(3H，s，OCH3-7)，2.07 (3H，s，CH3-6)，3.67 (3H，s，CH3-2);13C NMR (CDCl3，100 MHz):δ 142.0 (C-1)，162.8 (C-3)，116.7 (C-4)，138.9 (C-4a)，183.5 (C-5)，133.1 (C-6)，159.5 (C-7)，177.3 (C-8)，111.3 (C-8a)，38.4 (C-9)，9.5 (C-CH3)，61.3(C-OCH3);EI-MS (m/z):233 (M+)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］對照基本一致，故鑒定化合物7 為isoquinolinequinones mimosamycin。

化合物8 白色針晶，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 5.33 (1H，t，J =2.5 Hz)，3.50 (1H，m)，0.98 (3H，s，CH3-19)，0.90～0.78 (9H，m)，0.66(3H，s，CH3-18);EI-MS (m/z):386 (M+)，368，353，301，275，273，255，231，213，159。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］對照基本一致，故鑒定化合物8 為膽甾醇。

化合物9 白色固體，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ5.54 (1H，d，J = 3.9 Hz，H-6)，5.36 (1H，d，J = 3.9 Hz，H-7)，5.18 (2H，m，H-22，H-23)，3.61 (1H，m，H-3)，1.03 (3H，d，J = 6.6 Hz )，0.94 (3H，s)，0.91 (3H，d，J = 6.8 Hz)，0.84(3H，d，J = 6.8 Hz)，0.82 (3H，d，J = 6.6 Hz)，0.62 (3H，s);EI-MS (m/z):396 (M+)，363，271，253，211。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］對照基本一致，故鑒定化合物9 為麥角甾醇。

化合物10 白色固體，1H NMR (C5D5N，400 MHz):δ 5.76 (1H，br s)，5.25 (1H，m)，5.15 (1H，m)，4.82 (1H，m)，4.36 (1H，br d)，1.58 (3H，s)，0.68 (3H，s)，0.84 (3H，d，J = 6.8 Hz)，0.82(3H，d，J = 6.6 Hz)，0.62 (3H，s)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］對照基本一致，故鑒定化合物10 為(24R)-ergosta-7，22-diene-3β，5β，6β-triol。

化合物11 無色針晶，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 6.50 (1H，d，J = 8.5 Hz，H-7)，6.24 (1H，d，J = 8.5 Hz，H-6)，5.18 (2H，m，H-22，H-23)，3.97 (1H，m，H-3)，1.00 (3H，d，J = 6.6 Hz，CH3-21 )，0.91 (3H，d，J = 6.8 Hz，CH3-28)，0.88 (3H，s，CH3-19)，0.83 (3H，d，J = 6.8 Hz，CH3-27)，0.82 (3H，d，J = 6.6 Hz，CH3-26)，0.82 (3H，s，CH3-18);EI-MS (m/z):428 (M+)，410，397，396，303。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］對照基本一致，故鑒定化合物11 為5α，8α-epidioxycholest-6-en-3β-ol。

化合物12 白色固體，1H NMR (C5D5N，400 MHz):δ 7.70 (1H，s)，7.0 (1H，t)，5.02 (2H，m)，4.44 (1H，q)，4.24-4.10 (2H，m)，2.72 (2H，m)，1.84 (3H，s);ESI-MS (m/z):243［M+H］+。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］對照基本一致，故鑒定化合物12 為胸苷。

化合物13 白色固體，1H NMR (C5D5N，400 MHz):δ 8.38 (1H，d，J = 8.1 Hz)，6.96 (1H，t，J= 6.6 Hz)，5.90 (1H，d，J = 8.1 Hz)，4.97 (1H，m)，4.42 (1H，m)，4.15 (2H，m)，2.60 (2H，m)，1.84 (3H，s);ESI-MS (m/z):229［M+H］+。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］對照基本一致，故鑒定化合物13 為胞苷。

化合物14 無色油狀物，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 5.18 (6H，m，H-3，7，11，14，18，22)，2.15(20H，m，CH2-4，5，8，9，12，13，16，17，20，21)，1.69(6H，s，2 ×CH3)，1.60 (18H，s，6 ×CH3);13C NMR(CDCl3，100 MHz):δ 135.0 (C-10，15)，134.8 (C-6，19)，131.1 (C-2，23)，124.4 (C-3，22)，124.3(C-7，18)，39.7 (C-5，9，20，16)，28.2 (C-12，13)，26.7 (C-4，21)，26.6 (C-8，17)，25.6 (C-1，24)，17.6(2 CH3)，15.9 (4 CH3);EI-MS (m/z):410［M+］。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］對照基本一致，故鑒定化合物14 為鯊烯。

4 生物活性測試

在對這些化合物進(jìn)行廣泛的活性篩選后，發(fā)現(xiàn)化合物renierol (6)對黃嘌呤氧化酶有明顯的抑制作用，采用尿酸生成法［14］和超氧離子致NBT 顯色法［15］測定其對黃嘌呤氧化酶的抑制活性，IC50分別為1.85 μg/mL 和1.36 μg/mL，顯示其對黃嘌呤氧化酶有明顯的抑制作用。

表1 Renierol (6)對次黃嘌呤造成的小鼠高尿酸血癥模型的影響Table 1 Effect of renierol (6)on hypoxanthine-induced animal models of hyperuricemia

此外，還做了renierol (6)對次黃嘌呤造成的小鼠高尿酸血癥模型的影響實(shí)驗(yàn)［16］。結(jié)果如表1 所示，在實(shí)驗(yàn)條件下，renierol 組小鼠血清尿酸水平與正常值相比有不同程度的升高，但與生理鹽水相比，有顯著降低(P ＜0.01)，說明它能部分抑制由次黃嘌呤引起的血清尿酸水平的升高。

人體內(nèi)次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成黃嘌呤，黃嘌呤再在黃嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸，同時也生成一分子超氧離子，由于人體缺乏尿酸氧化酶，因此尿酸是嘌呤代謝的終產(chǎn)物，最后通過腎臟排出體外，血中尿酸長期偏高就會造成痛風(fēng)。黃嘌呤氧化酶是尿酸生成的關(guān)鍵酶，可以作為降尿酸藥物的靶點(diǎn)。黃嘌呤氧化酶的活性可以通過其產(chǎn)物的生成量來測定，本實(shí)驗(yàn)通過分別測定尿酸和超氧離子的生成，觀察renierol 體外對黃嘌呤氧化酶活性的影響，兩者的結(jié)果一致，證明renierol 是黃嘌呤氧化酶的抑制劑。為了證明其在體內(nèi)是否也具有降尿酸作用，采用尿酸生成的前體物質(zhì)(次黃嘌呤)造成小鼠高尿酸血癥，試驗(yàn)結(jié)果證明renierol 在體內(nèi)也有明顯的降尿酸作用，其作用稍弱于別嘌呤醇，但由于它是天然產(chǎn)物，毒性作用小，很有希望開發(fā)成防治痛風(fēng)的新藥。

1 Kim JS，Lim YJ，Im KS，et al. Cytotoxic polyacetylenes from the marine sponge Petrosia sp.. J Nat Prod，1999，62:554-559.

2 Elenkov I，Popov S，Andreev S. Sterols from two Black Sea sponges (Haliclona Sp.). Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochem ＆ Mole Bio，1999，123:357-360.

3 Gulavita NK，Silva ED，Hagdone MR，et al.Nitrogenous bisabolene sesquiterpenes from marine invertebrates. J Org Chem，1986，51:5136-5139.

4 Nakamura H，Kobayashi J，Yasushi O.Novel bisabolene-type sesquiterpenoids with a conjugated diene isolated from the okinawan sea sponge Theonella cf. swinhoei. Tetrahedron Lett，1984，25:5401-5404.

5 Aldrich Library of NMR spectra 6:153B.

6 Tawnya CM，Chris MI.Cytotoxic and Antimicrobial Alkaloids from the Fijian Sponge Xestospongia caycedoi. J Nat Prod，1987，50:754-756.

7 Pettit GR，Collins JC，Herald DL. Isolation and structure of cribrostatins 1 and 2 from the blue marine sponge Cribrochalina sp.Can J Chem，1992，70:1170-1175.

8 Klenzle VF，Mayer Hans. Synthese von optisch aktiven，naturlichen Carotinoiden und strukturell verwandten Naturprodukten. 11. Synthese von(3S，3’s)-Astaxanthin. Helv Chim Acta，1978，61:2609-2615.

9 Yu DQ(于德泉)，Yang JS(楊峻山). Analytical Chemistry Manual in 9 (分析化學(xué)手冊，第九分冊).Beijing:Chemical Industry Press，1999.837-838.

10 Kobayashi M，Krishna MM，Haribabu B. Marine Sterols.XXV.Isolation of 23-demethylgorgost-7-ene-3β，5β，6β，7β，15β-pentol from soft corals of the Andaman and Nicobar coasts.Chem Pharm Bull，1993，41:87-89.

11 Gauvin A，Smadja J. Isolation of bioactive 5a，8a-epidioxy sterols from the marine sponge Luffariella cf.variabilis.Can J Chem，2000，78:986-987.

12 Yu DQ(于德泉)，Yang JS(楊峻山). Analytical Chemistry Manual in 9(分析化學(xué)手冊，第九分冊).Beijing:Chemical Industry Press，1999.581-582.

13 Jamie SS，Payul R，Mary JG. Biosynthesis of dichloroimines in the tropical marine sponge stylotella aurantium. Tetrahedrom lett，1997，38:794-798.

14 Shang YJ(尚雁君)，Huang CG(黃才國)，Jiao BH(焦炳華).Inhibition of xathine oxidase by rosmarinic acid.Acad J Second Military Med Univ(第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報)，2006，27:189-192.

15 Valentao P，F(xiàn)ernandes E，Carvalho F，et al.Antioxidant activity of Centaurium erythraea infusion evidenced by its superoxide badical scavenging and xanthine oxidase inhibitory activity.J Agric Food Chem，2001，49:3476-3479.

16 Wang HD(王海東)，Ge F(葛飛)，Guo YS(郭玉松)，et al.Effects of aqueous extract in herba of Lysimachia christinae on hyperuricemia in mice. Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2002，27:939-944.