大黃酸氨基酸衍生物合成及放射增敏作用的初步研究

李濟(jì)洋，朱澤紅，郝建秀，周則衛(wèi)，李瑞峰，李光強(qiáng)，徐文清

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所藥物室，天津300192

放射療法是現(xiàn)代腫瘤治療的主要手段，射線照射生物體后，直接損傷生物大分子DNA 或通過(guò)其產(chǎn)生的自由基間接損傷DNA 或細(xì)胞［1］。由于腫瘤細(xì)胞增殖快，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞乏氧。這是腫瘤細(xì)胞對(duì)射線不敏感的重要因素［2］。放射增敏劑能夠提高腫瘤中乏氧細(xì)胞對(duì)射線的敏感性，增強(qiáng)射線對(duì)腫瘤的細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，對(duì)提高臨床放療效果具有重要意義。

近年來(lái)的研究表明，大黃酸可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3］、細(xì)胞周期抑制［4］、阻止DNA 損傷修復(fù)［5］、抑制血管生成［6］等作用發(fā)揮一定的抗癌活性。由于癌細(xì)胞增殖迅速，需要更多的氨基酸，如嘗試將大黃酸與各種氨基酸分子連接，組成新的化合物，則有可能更易將目標(biāo)化合物靶向作用于癌細(xì)胞。本文選用大黃酸作為母體，引入腫瘤增殖中大量需要的氨基酸，進(jìn)行放射增敏活性的研究。希望能從此類(lèi)化合物中尋找到具有較好放射增敏活性且低毒副作用的候選化合物，為蒽醌類(lèi)天然產(chǎn)物放射增敏劑的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

大黃酸(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度＞98.0%)，L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸，L-色氨酸，L-蛋氨酸，L-脯氨酸(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，純度＞99.0%);2-氨基丁酸乙酯鹽酸鹽(上海瀚鴻化工科技有限公司，純度＞99.0%);甲醇、甲苯、甲酸、二氯甲烷、氯仿、石油醚、N，N 二甲基甲酰胺、三乙胺、二氯亞砜、鹽酸(天津市化學(xué)試劑二廠，分析純);氫氧化鈉(天津市化學(xué)試劑三廠，分析純);硅膠(青島海洋化工);薄層預(yù)制板(煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司)等。鹽酸表柔比星(浙江海正藥業(yè)，10 mg/支);DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen Corporation);胎牛血清(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所);胰酶(Genview);MTT(Genview，純度＞98.0%);DMSO(天津復(fù)光精細(xì)化工)。肺癌H460 細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)。137Cs 放射源，劑量率:0.78 Gy/min。

冷阱(河南鞏義予華儀器有限公司);超聲儀(天津市瑞普電子儀器公司);BUCHI 1535 熔點(diǎn)測(cè)定儀(瑞士BUCHI 公司);RE-5299 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);恒溫磁力攪拌器(河南鞏義市英峪予華儀器有限責(zé)任公司);循環(huán)水真空泵(河南鞏義市英峪予華儀器有限責(zé)任公司);水浴鍋(北京醫(yī)療設(shè)備總廠);BS124S 電子天平(Sartorius);高效液相色譜儀(Waters2695);Varian Mercury V×300 型核磁共振儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 合成部分

先將氨基酸酯化，保護(hù)羧基。再用EDC 和HOBt 在堿性條件下，使大黃酸與氨基酸甲酯縮合。然后堿化脫酯，再酸化得到縮合產(chǎn)物。

?

1.2.2 合成實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.2.1 亮氨酸、異亮氨酸和色氨酸甲酯鹽酸鹽的合成

加50 mL 甲醇于100 mL 圓底燒瓶中，置于冷阱中15 min，溫度計(jì)測(cè)定燒瓶?jī)?nèi)甲醇溫度保持在-10℃以下。稱取1.5 g 亮氨酸(異亮氨酸、色氨酸)，加入圓底燒瓶中。沿瓶壁，緩慢多次地加入1.5 eq 的二氯亞砜液體，期間隨時(shí)監(jiān)測(cè)瓶?jī)?nèi)溫度，保持在-10℃以下。然后冷阱中攪拌至氨基酸溶解后，繼續(xù)攪拌1 h，再轉(zhuǎn)移至室溫，攪拌過(guò)夜。發(fā)現(xiàn)析出少量白色晶體，減壓抽干，加入適量二氯甲烷，反復(fù)抽干兩次，得到亮氨酸(異亮氨酸、色氨酸)甲酯鹽酸鹽。測(cè)定固體熔點(diǎn)，與文獻(xiàn)值比較。

1.2.2.2 天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸和脯氨酸甲酯的合成

同上，試圖合成天冬氨酸(谷氨酸、蛋氨酸、脯氨酸)甲酯鹽酸鹽。加入二氯亞砜(天冬氨酸和谷氨酸加3 eq)，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后，發(fā)現(xiàn)未析出白色晶體。減壓抽濾，無(wú)法抽干，得到的是粘稠油狀物。向油狀物加入一定量的0.5 mol/L NaOH 液體，攪拌溶解，pH 試紙檢測(cè)pH 至中性或略堿性。用二氯甲烷反復(fù)多次萃取該溶液，TCL(氯仿∶三乙胺 = 30∶1)，茚三酮顯色，與原料比較。只有一個(gè)比明顯較原料極性小的點(diǎn)時(shí)，保留溶液，待用。

1.2.2.3 大黃酰氨基酸甲酯的合成

在50 mL 圓底燒瓶中加入40 mg 大黃酸，38.4 mg EDC(HCl，20 mg HOBt，2eq 的氨基酸鹽酸鹽或適量的氨基酸甲酯液體，然后加入適量二氯甲烷，再加入4～5 eq 的三乙胺，攪拌，溶解，變紫紅色澄清液體。室溫?cái)嚢? h，TCL(氯仿作展開(kāi)劑)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。過(guò)柱，氯仿洗脫，收集第二條帶，旋干得大黃酰氨基酸酯。

1.2.2.4 大黃酰氨基酸的合成

向上述大黃酰氨基酸甲酯中，加入1 M NaOH溶液，45 ℃攪拌1 h 后，逐滴加入10%鹽酸，紫色溶液變淺，至析出淡黃色固體，再加兩滴，至溶液攪拌不再變紫。過(guò)濾，再用水沖洗兩遍，乙醇沖洗一遍，干燥，得黃色大黃酰氨基酸固體。TCL(甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸 = 7.5∶2∶0.5)得只有一個(gè)比原料大黃酸極性大的黃點(diǎn)。測(cè)算產(chǎn)率，打譜。

1.2.3 抑瘤活性測(cè)定

1.2.3.1 待測(cè)儲(chǔ)備液配制

大黃酸衍生物適量溶于1.2 個(gè)當(dāng)量5% NaHCO3溶液中，水浴蒸干，得到紫色的大黃酰氨基酸鈉鹽，分別稱取其鈉鹽適量用5%葡萄糖注射液配制成適宜濃度的儲(chǔ)備液，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，除菌后密封冷藏備用。同理，配制了大黃酸鈉的儲(chǔ)備液作為1 號(hào)化合物，以及表柔比星陽(yáng)性對(duì)照液。

1.2.3.2 MTT 法測(cè)IC50和IC20值

肺癌H460 細(xì)胞接種于含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d 更換培養(yǎng)液，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并稀釋成2 ×104個(gè)/mL 細(xì)胞液，按200 μL/孔接種于96 孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。用各化合物貯備液逐級(jí)稀釋6～7 個(gè)濃度梯度給藥，每組5～6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48 h 后，加入MTT 試液(5 mg/mL)15 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL/孔，振搖5 min，酶標(biāo)儀492 nm 處測(cè)定吸收值，根據(jù)下式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，擬合劑量存活曲線，計(jì)算各藥物IC50及IC20值。

1.2.4 各化合物的放射增敏活性初步評(píng)價(jià)

由MTT 結(jié)果，選取大黃酰亮氨酸鈉和大黃酰異亮氨酸鈉做初步放射增敏實(shí)驗(yàn)，大黃酸鈉作原料對(duì)比，表柔比星作為陽(yáng)性對(duì)照。選取這四個(gè)化合物的48 h IC15和IC20值作放射增敏測(cè)試濃度。按2 ×104個(gè)/mL 細(xì)胞液，200 μL/孔接種于96 孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。加藥，培養(yǎng)24 h 后照射。分五個(gè)劑量組，0、1、2、4、6 Gy，照射后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入15 μL MTT(5 mg/mL)試液，培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL/孔，振搖5 min，酶標(biāo)儀492 nm 處測(cè)定吸收值。用單因素方差分析法比較單純照射組和照射合并給藥組，初步判斷是否有放射增敏作用。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 HPLC 純度測(cè)定結(jié)果

色譜條件:ODS 色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇∶0.1%磷酸水溶液(85∶15);流速:l mL/min;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣量:10 μL。樣品濃度:10～20 μg/mL。面積歸一化法計(jì)算，各化合物純度均大于95.0%。

2.1.2 產(chǎn)率和結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

化合物2 黃色粉末狀固體;mp. 201～205 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ (ppm):12. 69 (s，1H，4'-COOH)，11. 89(s，2H，1 and 8-OH)，9.10-9.07 (d，1H，2'-H)，8.17-8.16 (s，1H，4-H)，7.85～7.73 (m，3H，5，6，7-H)，7.42-7.39 (d，1H，2-H)，4.49-4.42 (m，1H，3'-H)，1.84-1.58 (m，3H，5'-H，6'-H)，0.95～0.88 (dd，6H，7'-H，8'-H)，產(chǎn)率64.3%。

化合物3 黃色粉末狀固體;mp. 210～212 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ (ppm):12. 73 (s，1H，4'-COOH)，11. 91(s，2H，1 and 8-OH)，9.00～8.97 (d，1H，2'-H)，8.12 (s，1H，4-H)，7.85～7.72 (m，3H，5，6，7-H)，7. 42～7. 39 (d，1H，2-H)，4. 36-4. 31 (t，1H，3'-H)，1.97 (s，1H，5'-H)，1.34～1.22 (m，2H，7'-H)，0.96-0.86 (m，6H，6'-H，8'-H)，產(chǎn)率60.2%。

化合物4 黃色粉末狀固體;mp. 214～218 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ (ppm):12. 72 (s，2H，4'and 6'-COOH)，11.87 (s，2H，1 and 8-OH)，9.23-9.20 (d，1H，2'-H)，8.13 (s，1H，4-H)，7.84-7.72 (m，3H，5，6，7-H)，7.41～7.33 (t，1H，2-H)，4.80～4.72 (q，1H，3'-H)，2. 91-2. 70 (m，2H，5'-H)，產(chǎn)率28.9%。

化合物5 黃色粉末狀固體;mp. 221～225 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ (ppm):12. 42 (s，2H，4'and 7'-COOH)，11.83～11.81 (d，2H，1 and 8-OH)，9.05～9.03(d，1H，2'-H)，8.12 (s，1H，4-H)，7.80～7.68(m，3H，5，6，7-H)，7.36～7.39 (d，1H，2-H)，4.44 (s，1H，3'-H)，2.40～2.36 (t，2H，6'-H)，2.14～1.95 (m，2H，5'-H)，產(chǎn)率35.7%。

化合物6 棕色粉末狀固體;mp. 140～142 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ(ppm):12.70 (s，1H，4'-COOH)，11.83 (s，2H，1 and 8-OH)，10.78 (s，1H，8'-H)，9.12 (s，1H，2'-H)，8.08 (s，1H，4-H)，7.79～7.70 (m，3H，5，6，7-H)，7.60～7.57 (d，1H，2-H)，7.36～7.28 (m，2H，11' and 14'-H)，7.19 (s，1H，7'-H)，7.06～6.94 (m，2H，12' and 13'-H)，4. 69(s，1H，3'-H)，3.35～3.19 (m，2H，5'-H)，產(chǎn)率27.8%。

化合物7 黃色粉末狀固體;mp. 237～240 ℃(分解);1H NMR (300 MHz;DMSO-d6/TMS，25 ℃)δ(ppm):12. 77 (s，1H，4'-COOH)，11. 84 (s，2H，1 and 8-OH)，9.08-9.06 (d，1H，2'-H)，8.12(s，1H，4-H)，7.77～7.68 (m，3H，5，6，7-H)，7.37-7.34 (d，1H，2-H)，4.55～4.53 (d，1H，3'-H)，2.59～2.56 (d，2H，5'-H)，2.06 (s，5H，6'and 8'-H)，產(chǎn)率33.6%。

化合物8 黃色粉末狀固體;mp. 114～117 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ(ppm):12.67 (s，1H，7'-COOH)，11.88 (s，2H，1 and 8-OH)，8.06 (s，1H，4-H)，7.80-7.51(m，3H，5，6，7-H)，7.39～7.12 (m，1H，2-H)，4.43～4.34 (m，1H，3'-H)，3.61-3.49 (m，2H，6'-H)，2.30～2.29 (d，2H，4'-H)，1.90 (s，2H，5'-H)，產(chǎn)率21.5%。

化合物9 黃色粉末狀固體;mp. 260～266 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ(ppm):12.76 (s，1H，4'-COOH)，11.89 (s，1H，1 or 8 -OH)，9.08 (s，1H，2'-H)，8.16(s，1H，4-H)，7.81～7.68 (m，3H，5，6，7-H)，7.41～7.31 (d，1H，2-H)，4.30 (s，1H，3'-H)，1.85-1.64 (m，2H，5'-H)，1.03～0.97 (m，3H，6'-H)，產(chǎn)率72.4%。

2.2 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 各化合物對(duì)H460 細(xì)胞作用24 h 和48 h 后的IC20和IC50值Fig.3 IC20 and IC50 values of each compound after 24 h and 48 h treatment in H460 cells

表2 各化合物分別作用24、48 h 后對(duì)H460 細(xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果Table 2 Inhibitory effects of each compound on H460 cells in 24 h and 48 h

如圖3 所示，大黃酰亮氨酸鈉(化合物2)和大黃酰異亮氨酸鈉(化合物3)在24 h 的IC20和IC50值顯著小于大黃酸鈉的值。雖然48 h 的數(shù)值差距變小，但也說(shuō)明了這兩個(gè)化合物較原料大黃酸鈉有更顯著的抑制作用。而其他化合物的抑制作用較原料無(wú)明顯提高，甚至有明顯下降(化合物4 和5)。詳細(xì)數(shù)據(jù)可見(jiàn)表2。該部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0單因素ANOVA 方差分析檢驗(yàn)，P ＜0.05 具有顯著性差異。

2.3 增敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖4 所見(jiàn)，相對(duì)于單純照射組，大黃酸鈉和大黃酸亮氨酸鈉并未表現(xiàn)出放射增敏作用。而照射合并大黃酸異亮氨酸鈉(化合物3)組的吸收值雖大于陽(yáng)性對(duì)照組，但小于單純照射組。說(shuō)明大黃酰異亮氨酸鈉表現(xiàn)出了放射增敏作用。表3 所列的是選取化合物合并照射作用得到的詳細(xì)OD(492 nm)吸收值。括號(hào)內(nèi)數(shù)字是各化合物的給藥濃度，單位為μmol/L。

圖4 所選取化合物的放射增敏結(jié)果Fig.4 Radiosensitizing results of selected compounds

表3 所選取化合物合并照射所得OD492吸收值(n = 6，±s)Table 3 OD492 values obtained by combining selected compounds with radiation(n = 6，±s)

表3 所選取化合物合并照射所得OD492吸收值(n = 6，±s)Table 3 OD492 values obtained by combining selected compounds with radiation(n = 6，±s)

注:與單純對(duì)照組相比，(P ＜0.01;* P ＜0.05Note:Compare with control，#P ＜0.01;* P ＜0.05

劑量(dosage)單純照射組(radiation alone)照射合并表柔比星(combine radiation with Epirubicin )照射合并大黃酸鈉(combine radiation with sodium rhein)照射合并大黃酰亮氨酸鈉(combine radiation with sodium rhein-Leu)照射合并大黃酰亮氨酸鈉(combine radiation with sodium rhein-Leu )IC15(1.01) IC20(1.42) IC15(40.87)IC20(55.89) IC15(7.07) IC20(11.47)IC15(52.71) IC20(66.45)01.926 ±0.089 1.019 ±0.057*1.099 ±0.199*1.876 ±0.068 1.810 ±0.102 1.996 ±0.234 1.921 ±0.044 1.696 ±0.044*1.587 ±0.079*1.416 ±0.079*21.436 ±0.028 11.719 ±0.048 0.767 ±0.123*0.583 ±0.059*1.526 ±0.071*1.427 ±0.049*1.709 ±0.085 1.728 ±0.077 1.513 ±0.103*1.107 ±0.113*41.199 ±0.041 0.557 ±0.060*0.433 ±0.060*1.334 ±0.437*1.309 ±0.037*1.405 ±0.038 1.407 ±0.038 1.226 ±0.056*0.877 ±0.081*60.877 ±0.052 0.500 ±0.029*0.348 ±0.043*1.115 ±0.079*1.033 ±0.031*1.078 ±0.034*1.084 ±0.035*0.953 ±0.057*0.345 ±0.069*0.290 ±0.035*0.821 ±0.122 0.840 ±0.066 0.832 ±0.087 0.830 ±0.043 0.743 ±0.048*0.692 ±0.043*

2.4 討論

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸對(duì)乳腺癌［7］、宮頸癌［8］、結(jié)腸癌［9］、鼻咽癌［10］、肝癌［4］細(xì)胞均有一定的抑制增殖作用。故本文以大黃酸為母體化合物，接入腫瘤增殖中大量需要的氨基酸，希望能從中尋找到具有較好放射增敏活性且低毒副作用的放射增敏劑。由于大黃酸和所得的大黃酰氨基酸在水和脂性試劑中均不溶，所以將它們都轉(zhuǎn)換成鈉鹽，改善水溶性，以期達(dá)到更好的抗腫瘤活性。結(jié)果顯示，大黃酸鈉和所得的大黃酰氨基酸鈉鹽表現(xiàn)出明顯的時(shí)間和濃度依賴性抗癌活性。與大黃酸鈉相比，大黃酰亮氨酸鈉和大黃酰異亮氨酸鈉對(duì)H460 細(xì)胞的IC50值更小，說(shuō)明有更強(qiáng)的抑制增殖的作用。而其他大黃酰氨基酸鈉鹽并無(wú)此表現(xiàn)。甚至在測(cè)定大黃酰色氨酸鈉24、48 h 和大黃酰脯氨酸鈉48 h 時(shí)，低濃度可顯著地促進(jìn)增殖。

初步的放射增敏結(jié)果顯示，在相應(yīng)化合物的48 h IC15和IC20濃度，陽(yáng)性對(duì)照表柔比星有明顯的放射增敏作用，大黃酰異亮氨酸也已表現(xiàn)出放射增敏作用，而大黃酸鈉和大黃酰亮氨酸鈉沒(méi)有顯示出放射增敏作用。但這只是初步完成了放射增敏測(cè)定，后續(xù)還需克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果。

1 Gao CL(高春玲)，Gao CL(高春麗)，Song WF(宋維芳)，et al.放射增敏劑的增敏機(jī)制.J Mod Oncol(現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué))，2007，15:890-892.

2 Peng F(彭芳)，Chen M(陳明).抗血管生成和腫瘤血管正?；难芯窟M(jìn)展.Chin J Lung Cancer(中國(guó)肺癌雜志)，2009，12:799-804.

3 Chang CY，Chan HL，Lin HY，et al.Rhein induces apoptosis in human breast cancer cells. Evid Based Complement Alternat Med，2012，Accepted.

4 Shi P，Huang Z，Chen G. Rhein induces apoptosis and cell cycle arrest in human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells.Am J Chin Med，2008，36:805-813.

5 Chen YY，Chiang SY，Lin JG，et al.Emodin，aloe-emodin and rhein inhibit migration and invasion in human tongue cancer SCC-4 cells through the inhibition of gene expression of matrix metalloproteinase-9.Int J Oncol，2010，36:1113-1120.

6 Fernand VE，Losso JN，Truax RE，et al.Rhein inhibits angiogenesis and the viability of hormone-dependent and -independent cancer cells under normoxic or hypoxic conditions in vitro.Chem Biol Interact，2011，192:220-232.

7 Lin YJ，Zhen YS. Rhein lysinate suppresses the growth of breast cancer cells and potentiates the inhibitory effect of Taxol in athymic mice. Anticancer Drugs，2009，20(1):65-72.

8 Ip SW，Weng YS，Lin SY，et al.The role of Ca+2 on rheininduced apoptosis in human cervical cancer Ca Ski cells.Anticancer Res，2007，27:379-389.

9 Ge X，Luo X，Chen Y，et al.Rhein induces apoptosis of HCT-116 human colon cancer cells via activation of the intrinsic apoptotic pathway.African J Biotech，2011，10:13244-13251.

10 Lin ML，Chen SS，Lu YC，et al. Rhein induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress and Ca2+-dependent mitochondrial death pathway in human nasopharyngeal carcinoma cells. Anticancer Res，2007，27:3313-3322.