應(yīng)用ADx-ARMS法對(duì)大腸癌組織中K- ras 基因突變的檢測(cè)

高 穎 昌 紅 沈 兵 石 峰 張建英

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院病理科，北京 100038

大腸癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道腫瘤惡性腫瘤，近年來(lái)隨工業(yè)化和城市化程度的增高、 居民飲食結(jié)構(gòu)的改變，發(fā)病率逐年上升。 2011 年4 月在全國(guó)第17 個(gè)腫瘤防治周時(shí)發(fā)布的最新數(shù)據(jù)表明，北京、上海等大城市大腸癌年發(fā)病率接近40/10 萬(wàn)，成為僅次于肺癌的第二位高發(fā)惡性腫瘤，是北京市發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一。

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，越來(lái)越多的研究表明基因突變是腫瘤發(fā)生的重要因素。大腸癌的發(fā)生與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路系統(tǒng)的功能異常相關(guān)，其中Ras/MAPK 是誘發(fā)細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。位于表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）下游的K-ras 基因在大腸癌中被認(rèn)為是啟動(dòng)腫瘤癌變的關(guān)鍵基因之一。 K-ras 基因位于12 號(hào)染色體，是Ras 基因家族成員之一，是一種原癌基因，長(zhǎng)約35 kb，編碼K-ras 蛋白。 研究表明，其與腫瘤的生成、增殖、遷移、擴(kuò)散以及血管生成均有密切關(guān)系。 K-ras 被公認(rèn)為可用于臨床實(shí)踐的大腸癌有效標(biāo)志物[1-2]。

既往，針對(duì)大腸癌的各種治療方案選擇中主要依據(jù)是患者的性別、年齡、體重等因素來(lái)確定，千人一藥一量的用藥原則，導(dǎo)致了患者往往從中獲得不同的療效，既有患者從中受益，又有無(wú)效的治療案例，因此個(gè)體化治療逐步受到重視。 個(gè)體化治療的前提是治療靶點(diǎn)的檢測(cè)。 一項(xiàng)涉及9 個(gè)國(guó)家及地區(qū)、千人以上規(guī)模的研究顯示，沒(méi)有進(jìn)行靶標(biāo)檢測(cè)而進(jìn)行靶向治療，其死亡風(fēng)險(xiǎn)將增加。 因此靶點(diǎn)檢測(cè)已經(jīng)成為靶向藥物使用前必須檢測(cè)的項(xiàng)目。2009 年NCCN指南中明確指出大腸癌在使用相關(guān)靶向藥物之前必須進(jìn)行K-ras 基因突變的檢測(cè)。 但目前我國(guó)國(guó)內(nèi)K-ras 基因檢測(cè)方法相差很遠(yuǎn)，檢測(cè)的敏感性、特異性差異巨大，應(yīng)用分子水平的在大腸癌中的突變尚無(wú)大規(guī)模的數(shù)據(jù)。本研究以大腸癌患者作為研究對(duì)象，應(yīng)用ADx-ARMS 方法，從分子水平檢測(cè)K-ras 基因突變的狀況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院2012 年4月～8 月的大腸癌標(biāo)本40 例。 其中男26 例，女14 例；年齡32～86 歲，中位年齡63.5 歲；＜60 歲者17 例，≥60 歲者23例；高分化腺癌5 例，中-低分化腺癌29 例，黏液腺癌6 例；所有病例均經(jīng)術(shù)前或術(shù)后病理切片確診，術(shù)前未接受放化療。

1.2 試劑與方法

1.2.1 檢測(cè)區(qū)域的選擇 比照蘇木精-伊紅染色（HE）在顯微鏡下標(biāo)記腫瘤區(qū)域， 切片過(guò)程中僅選取相關(guān)腫瘤區(qū)域，避免選擇出血及壞死較多的區(qū)域。切取5 μm 蠟?zāi)?0 張于潔凈的環(huán)氧樹脂（EP）管中，嚴(yán)格做到每一個(gè)病例應(yīng)用一個(gè)新的切片，并應(yīng)用乙醇進(jìn)行相關(guān)器具的消毒處理。

1.2.2 石蠟組織脫蠟處理 加入1 mL 組織脫蠟劑，Vertex混勻后靜置1 min，12 000 r/min 離心1 min 后棄上清，重復(fù)2 次。 加入無(wú)水乙醇1 mL 混勻后靜置1 min，12 000 r/min離心1 min 后棄上清，重復(fù)2 次。 將EP 管打開(kāi)，至于37℃的溫箱中20 min，使乙醇充分揮發(fā)。

1.2.3 樣本DNA 提取 待組織中乙醇揮發(fā)干凈后，應(yīng)用Qi-Aamp DNA FFPE Tissue Kit 試劑盒（Qiagen 公司生產(chǎn)），對(duì)樣本進(jìn)行DNA 提?。ǚ椒▍⒄赵噭┖姓f(shuō)明）。

1.2.4 樣本DNA 質(zhì)量檢測(cè) DNA 提取后應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA 質(zhì)量及濃度。按照測(cè)量的DNA 濃度稀釋至2～5 mg/L 備用。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè) 應(yīng)用廈門艾德公司生產(chǎn)的ADx-ARMS-k-ras 檢測(cè)試劑盒，對(duì)K-ras 基因2 號(hào)外顯子12、13密 碼 子 的7 個(gè) 突 變 熱 點(diǎn)（Gly12Asp、Gly12Ala、Gly12Val、Gly12Ser、Gly12Arg、Gly12Cys 及Gly13Asp）進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 8.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。 以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 K-ras 基因突變檢測(cè)結(jié)果

40 例大腸癌樣本中共發(fā)現(xiàn)K-ras 基因突變14 例，突變率約為35.0%，共檢測(cè)到5 種突變類型，其中1 例為雙突變。 12 密碼子突變9 例，13 密碼子突變5 例。 見(jiàn)表1。

表1 K-ras 基因突變檢測(cè)結(jié)果（n = 40）

2.1 患者臨床、病理特征與K-ras 基因突變狀態(tài)關(guān)系

K-ras 基因突變與年齡及組織學(xué)分型無(wú)關(guān)（P > 0.05），與患者性別（P < 0.05）及腺癌分化程度（P < 0.01）有關(guān)。 見(jiàn)表2。

3 討論

由于大腸癌早期是沒(méi)有任何癥狀的，當(dāng)患者出現(xiàn)了膿血便、腸梗阻進(jìn)行性貧血而去就診時(shí)，病變多已進(jìn)展至中晚期，臨床分期較晚，從而喪失了許多治療機(jī)會(huì)。 每年約有四分之一新診斷的大腸癌患者伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，40%～50%的初診無(wú)轉(zhuǎn)移患者在診斷治療后也會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。 晚期轉(zhuǎn)移性大腸癌患者，如果不進(jìn)行治療，中位生存期僅為5～6個(gè)月。轉(zhuǎn)移性大腸癌五年生存率不足10%[3]。隨著人類基因組計(jì)劃的全面完成及后基因組時(shí)代的開(kāi)啟，越來(lái)越多的腫瘤癌基因被發(fā)現(xiàn)。 對(duì)于大腸癌形成及發(fā)展的機(jī)制研究不斷深入，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的理論逐步被廣大學(xué)者所接受和證實(shí)。 突變的Ras 基因可以持續(xù)激活RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路。 而K-ras 基因恰恰是該通路的重要相關(guān)基因，其突變可導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖及永生化[4]。 K-ras 基因位于12p12.1， 編碼位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的具有GTP 活性的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白，是EGFR 的下游分子，在膜受體腺苷環(huán)化酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮主要作用[5]。 在大腸癌的靶向治療中，EGFR 抑制劑及抗EGFR 單抗能特異性抑制野生型K-ras 基因的大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。 而K-ras 突變型大腸癌患者未能獲益， 主要因?yàn)镵-ras 基因突變后可導(dǎo)致Kras 蛋白不依賴上游信號(hào)而永久激活， 從而導(dǎo)致細(xì)胞永生化[6-7]。 因此，大腸癌K-ras 基因的突變狀態(tài)是決定靶向治療療效的關(guān)鍵指標(biāo)[8]。K-ras 基因在大腸癌中發(fā)生突變的概率高于其他基因[9]，其在大腸癌中的突變率在歐美國(guó)家報(bào)道為30%～68%，國(guó)內(nèi)報(bào)道為15%～35%[10]。

表2 患者臨床、病理特征與K-ras 基因突變狀態(tài)關(guān)系（n = 40）

本研究K-ras 突變率為35.0%，與相關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù)一致[10]，但本研究樣本量較小，可能存在抽樣誤差，進(jìn)一步大樣本研究將有助于減少誤差。 本研究發(fā)現(xiàn)，K-ras 突變以12、13密碼子的Gly13Asp 及Gly12Val 突變?yōu)橹鳎?這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道該試劑盒相關(guān)位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增效率高，靈敏度高，反應(yīng)低限可以達(dá)到1 copy/μL 的檢測(cè)結(jié)果相一致[11]。 由于突變型K-ras 基因患者不能從針對(duì)EGFR 的靶向治療中獲益，因此，中國(guó)大腸癌患者靶向治療前常規(guī)檢測(cè)K-ras 基因具有重要意義。本研究提示，K-ras 基因突變與患者性別及腫瘤的分化程度有相關(guān)性，與既往一些研究結(jié)果一致[12]。未發(fā)現(xiàn)K-ras 基因突變與年齡及腫瘤的病理學(xué)類型存在相關(guān)性，但也有研究發(fā)現(xiàn)K-ras 突變與年齡及性別存在相關(guān)性[13]。國(guó)內(nèi)大多數(shù)的相關(guān)研究采用的檢測(cè)手段差異較大，從檢測(cè)蛋白水平的免疫組織化學(xué)法到檢測(cè)分子水平的PCR 法，從傳統(tǒng)的直接測(cè)序法到焦磷酸測(cè)序， 從經(jīng)典的PCR 法到Real-Time PCR 等， 不同方法對(duì)樣本的檢測(cè)靈敏度相差甚遠(yuǎn)，檢測(cè)靈敏度1%～50%，因而產(chǎn)生了不同的檢測(cè)結(jié)果，得到了不同的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和結(jié)論。

目前國(guó)內(nèi)多采用Real-Time PCR 及測(cè)序法對(duì)臨床樣本進(jìn)行K-ras 突變檢測(cè)。 測(cè)序法是國(guó)內(nèi)大多數(shù)第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)所采用，該方法的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確性較高，可以檢測(cè)已知及未知突變，是檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于該方法敏感性低，只有突變的腫瘤細(xì)胞大于50%方可檢測(cè)，同時(shí)該方法運(yùn)行成本大、耗時(shí)，特別是對(duì)于臨床小穿刺活檢組織難以檢測(cè)，因而很難在醫(yī)院開(kāi)展。PCR 法因其靈敏度高，速度快，特別是對(duì)于樣本量較少的珍惜樣本有較好的接測(cè)結(jié)果從而被廣大得醫(yī)院所采用，目前主要得檢測(cè)方法有普通PCR、熒光定量PCR、高分辨率溶解度曲線法、ARMS 法等等。

本研究使用的是經(jīng)原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床體外診斷的ADx-ARMS-K-ras 檢測(cè)試劑盒。 該試劑盒采用稀有突變檢測(cè)技術(shù)，憑借特異性的環(huán)狀引物雙擴(kuò)增技術(shù)富集擴(kuò)增突變的DNA，同時(shí)結(jié)合使用雙環(huán)探針指示擴(kuò)增產(chǎn)物， 提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度，克服了傳統(tǒng)PCR，直接測(cè)序法等檢測(cè)過(guò)程中敏感度不高的缺點(diǎn)，將突變基因DNA 的含量下限降低到了1%。 可以有效地減少因標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞少，特別是由于穿刺活檢組織中突變腫瘤細(xì)胞稀少所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。 但該方法也存在這只能檢測(cè)已知突變的缺點(diǎn)。 由于目前研究的檢測(cè)方法的不同及檢測(cè)數(shù)據(jù)量所限，我國(guó)K-ras 基因突變的狀態(tài)尚不明確。 但隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，特別是第二代測(cè)序（焦磷酸測(cè)序）技術(shù)的應(yīng)用，將測(cè)序法的靈敏度提高到5%， 建議將ARMS 法與可以測(cè)定未知突變的測(cè)序法聯(lián)合使用，進(jìn)一步進(jìn)行多中心、大樣本研究有助于明確我國(guó)K-ras 基因突變與大腸癌的臨床、 病理分型及分級(jí)之間的相關(guān)性， 為21 世紀(jì)大腸癌量體裁衣的個(gè)體化用藥提供可靠的數(shù)據(jù)。

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