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    Toll樣受體系統(tǒng)在腎臟衰老中的表達(dá)變化

    2013-12-23 04:41:46白雪源陳香美
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2013年14期
    關(guān)鍵詞:月齡腎臟分子

    邵 楓 白雪源 陳香美

    解放軍總醫(yī)院腎病科 腎臟疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100853

    Toll受體(Toll-like receptors,TLRs)是天然免疫系統(tǒng)的受體之一,在啟動和調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答及誘導(dǎo)獲得性免疫中發(fā)揮重要作用。在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)11種TLRs成員。TLRs是一種特定的模式識別受體(pattern cognition receptors,PRRs),能識別細(xì)菌等病原體的相關(guān)分子結(jié)構(gòu)如脂多糖與脂蛋白等分子,然后激活其下游信號通路分子髓樣分化因子MyD88(myeloid differentiation factor 88)[1]。MyD88是TLRs信號通路重要的信號適配器,當(dāng)被活化后可進(jìn)一步激活I(lǐng)KK-NF-κB信號通路或JNK-NF-κB信號通路,促進(jìn)免疫炎性因子的表達(dá)[2-3]。TLR3則通過激活MyD88非依賴性信號通路促進(jìn)炎癥分子的表達(dá)。

    雖然已經(jīng)提出多種衰老學(xué)說如氧化應(yīng)激(oxidative stress)等,但是目前衰老的機(jī)制還不是很清楚[4-5],近年研究表明免疫炎癥可能與衰老的發(fā)生有關(guān)[6]。腎臟是人體內(nèi)能量代謝非?;钴S的器官,因此腎臟易于發(fā)生衰老,老年人腎臟功能隨年齡的增加逐漸降低[7],但是腎臟器官衰老的機(jī)制并不清楚。TLRs系統(tǒng)和腎臟衰老的關(guān)系目前尚不清楚。

    本研究擬通過研究TLRs及其下游MyD88信號通路分子炎癥因子在3、12、24月齡Fischer 344(F344)大鼠腎臟組織中的表達(dá)變化以探討TLRs在腎臟衰老中的作用及其機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物與標(biāo)本處理

    2月齡清潔級近交系雄性F344大鼠(體重180~190 g)購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心。實(shí)驗(yàn)動物分3月齡組(青年組),12月齡組(中年組)和24月齡組(老年組),每組各20只。每籠4只,飼養(yǎng)于溫度(22±1)℃、濕度40%環(huán)境中,自由飲食,12 h光照周期。待各組大鼠分別飼養(yǎng)至3、12、24個月后稱量體重,用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉,留取血樣,然后分別取出腎臟經(jīng)冰生理鹽水灌洗除去殘留血跡,稱取腎重。腎上極的腎組織投入10%的中性福爾馬林中固定,用于免疫組化和腎臟病理。腎下極快速投入OCT復(fù)合物中,用于免疫熒光染色。剩余的腎組織切除小塊投入液氮中,用于Western blot和qRT-PCR分析。

    1.2 生化檢測

    取血后3000 r/min離心10 min,收集血清,檢測血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCR)、血糖(GLU)、三酰甘油(TG)及膽固醇(CHOL)。用比色法檢測BUN和TG;酶法檢測SCR和CHOL;己糖激酶法檢測GLU。取尿液測定尿蛋白/肌酐比值,鄰苯三酚紅鉬法測定尿蛋白,肌氨酸氧化酶法測定尿肌酐。

    1.3 Western blot分析

    用預(yù)冷的RIPA裂解液(含50mmol/L Tris pH 7.5,150mmol/L NaCl,1% NP-40,0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS),10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)及蛋白酶抑制劑(2 mg/L aprotinin,2 mg/L leupeptin)提取腎組織總蛋白,進(jìn)行蛋白濃度測定和變性蛋白。取上樣量80~100μg,轉(zhuǎn)膜后用Western blot檢測各指標(biāo)變化。用5%牛血清蛋白(BSA)室溫封閉1 h,一抗TLR4、TLR6、TLR8、TLR10和TLR11(1∶200稀釋);TLR9(1∶250稀釋);TLR1、TLR3、TLR5、NF-κB p65和phospho-NF-κB p65(1∶500稀釋);TLR2、TLR7和IK-Bα(1∶1000稀釋),4℃過夜。二抗分別加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗羊、抗兔或抗鼠IgG(1∶1000稀釋),室溫孵育1 h,ECL顯影。結(jié)果以β-Actin的蛋白表達(dá)為內(nèi)參照,用AlphalmagerTM 2200凝膠圖象分析系統(tǒng),進(jìn)行半定量分析。

    1.4 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

    Trizol法提取腎臟組織RNA,按1 mL/100 mg組織在研磨 器 中 加 入Trizol試 劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。RNA用紫外分光光度計(jì)測定濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京,全式金生物技術(shù)有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板。

    1.5 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

    用Takara公司DRR081A系統(tǒng)檢測甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),白介素-12b(IL-12b),IL-6,趨化因子配體3(CCL3),CCL4,CCL5,細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule,ICAM-1),CD80和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA的表達(dá)。GAPDH為內(nèi)參照。各基因引物序列見表1。反應(yīng)體系20μL,包括:50 ng cDNA,0.4μmol/L引物和10μL 2×SYBR green buffer。每個樣本重復(fù)3次。反應(yīng)條件為94℃5 s、60℃30 s和72℃30 s,共40個循環(huán)。

    數(shù)據(jù)分析采用CT值法[8],ΔCT=CT(靶基因)-CT(內(nèi)參基因)。ΔCT值越高,表示表達(dá)量越低?!鳌鰿T=(CT靶基因-CT內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(CT靶基因-CT內(nèi)參基因)對照組。本實(shí)驗(yàn)對照組為3月齡組大鼠,實(shí)驗(yàn)組為12月齡組和24月齡組大鼠。相對于3月齡組大鼠,12月齡組和24月齡組大鼠改變的倍數(shù)(fold change)=2-ΔΔCT。

    表1 qRT-PCR引物序列和產(chǎn)物長度

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠腎臟功能變化

    12月齡組和24月齡組體重、腎重和尿蛋白/肌酐比值高于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24月齡組大鼠血BUN水平高于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而血SCR、GLU和CHOL水平三組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。24月齡組腎重和尿蛋白/肌酐比值高于12月齡組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    表2 大鼠腎臟功能和代謝功能變化(±s)

    表2 大鼠腎臟功能和代謝功能變化(±s)

    注:與3月齡組比較,*P<0.05;24月齡組與12月齡組比較,#P<0.05。BUN:尿素氮;SCR:血肌酐;GLU:血糖;TG:三酰甘油;CHOL:膽固醇

    組別 體重(g)腎重(g)血BUN(mmol/L)血SCR(mmol/L)GLU(mmol/L)TG(mmol/L)CHOL(mmol/L)尿蛋白/肌酐(mg/mmoL)3月齡組12月齡組24月齡組236.3±12.28 466.86±32.62*617.8±57.34*1.67±0.68 3.25±0.50*5.01±1.00*#5.73±0.47 6.51±0.40 6.86±1.10*27.15±2.60 25.62±1.94 25.8±2.04 7.09±1.02 5.745±0.29 6.09±1.31 1.20±0.32 2.32±0.46*3.22±0.82*1.55±0.16 2.73±0.28 3.11±0.36 146.01±22.72 164.81±38.31*256.00±49.39*#

    2.2 大鼠腎臟組織中TLRs分子表達(dá)水平變化

    12月 齡 組 和24月 齡 組TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR11表達(dá)水平均高于3月齡組,24月齡組TLR1和TLR3水平高于3月齡組,24月齡組TLR9水平高于3月齡組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);三組TLR6、TLR7、TLR10水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);TLR8未檢測到。24月齡組TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR11水平高于12月齡組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

    2.3 TLRs信號通路分子MyD88在衰老大鼠腎臟組織中的表達(dá)改變

    12月齡組和24月齡組MyD88水平高于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24月齡組MyD88水平高于12月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

    2.4 NF-ΚB信號通路在在大鼠腎臟組織中的表達(dá)變化

    利用Western blot檢測了NF-κB信號通路分子的表達(dá)變化,12月齡組和24月齡組IK-Bα和活化的磷酸化NF-κB p65(Phospho-NF-κB p65)水平高于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24月齡組NF-κB p65水平高于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。24月齡組NFκB p65和Phospho-NF-κB p65水平高于12月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

    2.5 炎癥因子在3組大鼠腎臟組織中的表達(dá)

    24月齡組CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF-α和IL-12b水平高于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);12月齡組CD80和IL-12b水平低于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。24月齡組CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF-α和IL-12b高于12月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

    3 討論

    天然免疫(固有免疫)系統(tǒng)是由于其可以啟動炎癥和免疫反應(yīng)以消除感染和修復(fù)受損組織而首先被發(fā)現(xiàn)的。TLRs在天然免疫和獲得性(適應(yīng)性)免疫誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。TLRs廣泛表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞,也可表達(dá)于一些組織器官細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞可表達(dá)TLR1~TLR4和TLR6。TLRs亦可表達(dá)于腎小球細(xì)胞。例如TLR4 mRNA可以在足細(xì)胞、鮑曼氏囊和系膜細(xì)胞表達(dá)[9]。

    TLRs(除TLR3)與病原體分子配體結(jié)合后可通過形成二聚體激活下游信號分子MyD88[10]。在靜止?fàn)顟B(tài)下,IκBα和NF-κB結(jié)合而抑制NF-κB,使NF-κB在細(xì)胞質(zhì)中處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)MyD88被活化后可激活I(lǐng)KKβ,從而導(dǎo)致IκBα的素化而從IκB/NF-κB復(fù)合物中釋放出來,NF-κB由此活化并轉(zhuǎn)位入核,從而激活一系列致炎因子基因如IL-6、CCL3、CCL4、CCL5、ICAM1、CD80、TNF-α和IL-12b等的表達(dá)[11-12]。TLR3則可通過MyD88依賴性信號通路激活NF-κB。

    近年研究發(fā)現(xiàn)TLRs與腎臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)[13]。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎小球腎炎中TLR7和TLR9表達(dá)顯著升高[14]。TLR2和TLR4在缺血再灌注腎損傷中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)TLR2基因缺失的小鼠可以免受功能性和組織性局部缺血的損害[15]。TLR1和TLR9在去鐵鐵蛋白(Apoferritin)誘導(dǎo)的腎炎中表達(dá)升高,且發(fā)現(xiàn)TLR9多態(tài)性和人類多種疾病包括IgA腎病相關(guān)[16]。研究發(fā)現(xiàn),TLR3配體可以通過NF-κB信號通路誘導(dǎo)CD80在人類腎臟足細(xì)胞的表達(dá)[17]。TLR2和TLR4在糖尿病腎病中發(fā)揮重要作用,特別是在高脂飲食的大鼠糖尿病模型中,TLR4和其下游的IKKβ/NF-κB通路明顯被激活[18-20]。但是,目前對TLRs系統(tǒng)在衰老腎臟中的作用尚不清楚。

    本研究首次系統(tǒng)地分析了在大鼠腎臟衰老過程中TLRs信號通路分子、NF-κB信號通路分子以及炎癥因子CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF-α和IL-12b的表達(dá)變化情況,發(fā)現(xiàn)在衰老腎臟中TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR11的表達(dá)顯著升高,而TLR6、TLR7和TLR10則未見明顯變化。隨后檢測了TLRs信號通路下游分子MyD88表達(dá),發(fā)現(xiàn)在衰老腎臟中MyD88水平也顯著升高。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控各種促炎因子表達(dá)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子,已發(fā)現(xiàn)TLR活化后可以激活NF-κB信號通路。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在衰老腎臟中NF-κB信號通路分子IκBα、NF-κB與Phospho-NF-κB表達(dá)明顯升高,相應(yīng)地,也發(fā)現(xiàn)在衰老腎臟組織中促進(jìn)炎癥因子CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF-α和IL-12b的表達(dá)明顯上調(diào)。這些結(jié)果顯示TLRs系統(tǒng)可能通過激活NF-κB信號通路、促進(jìn)炎癥因子表達(dá)而在腎臟衰老過程中發(fā)揮重要作用。

    近年研究表明免疫炎癥可能與衰老相關(guān)性疾病的發(fā)生有關(guān)。已發(fā)現(xiàn)在老年人群體內(nèi)炎癥因子如TNF-α、IL-6、C-反應(yīng)蛋白的血清水平顯著增加,但是對炎癥通過什么機(jī)制參與組織器官衰老則不太清楚。本研究顯示TLRs系統(tǒng)與腎臟器官衰老的發(fā)生密切相關(guān),這為今后進(jìn)一步明確腎臟衰老的機(jī)制提供了一種新方向。

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