• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Toll樣受體系統(tǒng)在腎臟衰老中的表達(dá)變化

    2013-12-23 04:41:46白雪源陳香美
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2013年14期
    關(guān)鍵詞:月齡腎臟分子

    邵 楓 白雪源 陳香美

    解放軍總醫(yī)院腎病科 腎臟疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100853

    Toll受體(Toll-like receptors,TLRs)是天然免疫系統(tǒng)的受體之一,在啟動和調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答及誘導(dǎo)獲得性免疫中發(fā)揮重要作用。在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)11種TLRs成員。TLRs是一種特定的模式識別受體(pattern cognition receptors,PRRs),能識別細(xì)菌等病原體的相關(guān)分子結(jié)構(gòu)如脂多糖與脂蛋白等分子,然后激活其下游信號通路分子髓樣分化因子MyD88(myeloid differentiation factor 88)[1]。MyD88是TLRs信號通路重要的信號適配器,當(dāng)被活化后可進(jìn)一步激活I(lǐng)KK-NF-κB信號通路或JNK-NF-κB信號通路,促進(jìn)免疫炎性因子的表達(dá)[2-3]。TLR3則通過激活MyD88非依賴性信號通路促進(jìn)炎癥分子的表達(dá)。

    雖然已經(jīng)提出多種衰老學(xué)說如氧化應(yīng)激(oxidative stress)等,但是目前衰老的機(jī)制還不是很清楚[4-5],近年研究表明免疫炎癥可能與衰老的發(fā)生有關(guān)[6]。腎臟是人體內(nèi)能量代謝非?;钴S的器官,因此腎臟易于發(fā)生衰老,老年人腎臟功能隨年齡的增加逐漸降低[7],但是腎臟器官衰老的機(jī)制并不清楚。TLRs系統(tǒng)和腎臟衰老的關(guān)系目前尚不清楚。

    本研究擬通過研究TLRs及其下游MyD88信號通路分子炎癥因子在3、12、24月齡Fischer 344(F344)大鼠腎臟組織中的表達(dá)變化以探討TLRs在腎臟衰老中的作用及其機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物與標(biāo)本處理

    2月齡清潔級近交系雄性F344大鼠(體重180~190 g)購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心。實(shí)驗(yàn)動物分3月齡組(青年組),12月齡組(中年組)和24月齡組(老年組),每組各20只。每籠4只,飼養(yǎng)于溫度(22±1)℃、濕度40%環(huán)境中,自由飲食,12 h光照周期。待各組大鼠分別飼養(yǎng)至3、12、24個月后稱量體重,用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉,留取血樣,然后分別取出腎臟經(jīng)冰生理鹽水灌洗除去殘留血跡,稱取腎重。腎上極的腎組織投入10%的中性福爾馬林中固定,用于免疫組化和腎臟病理。腎下極快速投入OCT復(fù)合物中,用于免疫熒光染色。剩余的腎組織切除小塊投入液氮中,用于Western blot和qRT-PCR分析。

    1.2 生化檢測

    取血后3000 r/min離心10 min,收集血清,檢測血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCR)、血糖(GLU)、三酰甘油(TG)及膽固醇(CHOL)。用比色法檢測BUN和TG;酶法檢測SCR和CHOL;己糖激酶法檢測GLU。取尿液測定尿蛋白/肌酐比值,鄰苯三酚紅鉬法測定尿蛋白,肌氨酸氧化酶法測定尿肌酐。

    1.3 Western blot分析

    用預(yù)冷的RIPA裂解液(含50mmol/L Tris pH 7.5,150mmol/L NaCl,1% NP-40,0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS),10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)及蛋白酶抑制劑(2 mg/L aprotinin,2 mg/L leupeptin)提取腎組織總蛋白,進(jìn)行蛋白濃度測定和變性蛋白。取上樣量80~100μg,轉(zhuǎn)膜后用Western blot檢測各指標(biāo)變化。用5%牛血清蛋白(BSA)室溫封閉1 h,一抗TLR4、TLR6、TLR8、TLR10和TLR11(1∶200稀釋);TLR9(1∶250稀釋);TLR1、TLR3、TLR5、NF-κB p65和phospho-NF-κB p65(1∶500稀釋);TLR2、TLR7和IK-Bα(1∶1000稀釋),4℃過夜。二抗分別加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗羊、抗兔或抗鼠IgG(1∶1000稀釋),室溫孵育1 h,ECL顯影。結(jié)果以β-Actin的蛋白表達(dá)為內(nèi)參照,用AlphalmagerTM 2200凝膠圖象分析系統(tǒng),進(jìn)行半定量分析。

    1.4 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

    Trizol法提取腎臟組織RNA,按1 mL/100 mg組織在研磨 器 中 加 入Trizol試 劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。RNA用紫外分光光度計(jì)測定濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京,全式金生物技術(shù)有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板。

    1.5 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

    用Takara公司DRR081A系統(tǒng)檢測甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),白介素-12b(IL-12b),IL-6,趨化因子配體3(CCL3),CCL4,CCL5,細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule,ICAM-1),CD80和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA的表達(dá)。GAPDH為內(nèi)參照。各基因引物序列見表1。反應(yīng)體系20μL,包括:50 ng cDNA,0.4μmol/L引物和10μL 2×SYBR green buffer。每個樣本重復(fù)3次。反應(yīng)條件為94℃5 s、60℃30 s和72℃30 s,共40個循環(huán)。

    數(shù)據(jù)分析采用CT值法[8],ΔCT=CT(靶基因)-CT(內(nèi)參基因)。ΔCT值越高,表示表達(dá)量越低?!鳌鰿T=(CT靶基因-CT內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(CT靶基因-CT內(nèi)參基因)對照組。本實(shí)驗(yàn)對照組為3月齡組大鼠,實(shí)驗(yàn)組為12月齡組和24月齡組大鼠。相對于3月齡組大鼠,12月齡組和24月齡組大鼠改變的倍數(shù)(fold change)=2-ΔΔCT。

    表1 qRT-PCR引物序列和產(chǎn)物長度

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠腎臟功能變化

    12月齡組和24月齡組體重、腎重和尿蛋白/肌酐比值高于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24月齡組大鼠血BUN水平高于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而血SCR、GLU和CHOL水平三組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。24月齡組腎重和尿蛋白/肌酐比值高于12月齡組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    表2 大鼠腎臟功能和代謝功能變化(±s)

    表2 大鼠腎臟功能和代謝功能變化(±s)

    注:與3月齡組比較,*P<0.05;24月齡組與12月齡組比較,#P<0.05。BUN:尿素氮;SCR:血肌酐;GLU:血糖;TG:三酰甘油;CHOL:膽固醇

    組別 體重(g)腎重(g)血BUN(mmol/L)血SCR(mmol/L)GLU(mmol/L)TG(mmol/L)CHOL(mmol/L)尿蛋白/肌酐(mg/mmoL)3月齡組12月齡組24月齡組236.3±12.28 466.86±32.62*617.8±57.34*1.67±0.68 3.25±0.50*5.01±1.00*#5.73±0.47 6.51±0.40 6.86±1.10*27.15±2.60 25.62±1.94 25.8±2.04 7.09±1.02 5.745±0.29 6.09±1.31 1.20±0.32 2.32±0.46*3.22±0.82*1.55±0.16 2.73±0.28 3.11±0.36 146.01±22.72 164.81±38.31*256.00±49.39*#

    2.2 大鼠腎臟組織中TLRs分子表達(dá)水平變化

    12月 齡 組 和24月 齡 組TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR11表達(dá)水平均高于3月齡組,24月齡組TLR1和TLR3水平高于3月齡組,24月齡組TLR9水平高于3月齡組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);三組TLR6、TLR7、TLR10水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);TLR8未檢測到。24月齡組TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR11水平高于12月齡組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

    2.3 TLRs信號通路分子MyD88在衰老大鼠腎臟組織中的表達(dá)改變

    12月齡組和24月齡組MyD88水平高于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24月齡組MyD88水平高于12月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

    2.4 NF-ΚB信號通路在在大鼠腎臟組織中的表達(dá)變化

    利用Western blot檢測了NF-κB信號通路分子的表達(dá)變化,12月齡組和24月齡組IK-Bα和活化的磷酸化NF-κB p65(Phospho-NF-κB p65)水平高于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24月齡組NF-κB p65水平高于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。24月齡組NFκB p65和Phospho-NF-κB p65水平高于12月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

    2.5 炎癥因子在3組大鼠腎臟組織中的表達(dá)

    24月齡組CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF-α和IL-12b水平高于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);12月齡組CD80和IL-12b水平低于3月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。24月齡組CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF-α和IL-12b高于12月齡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

    3 討論

    天然免疫(固有免疫)系統(tǒng)是由于其可以啟動炎癥和免疫反應(yīng)以消除感染和修復(fù)受損組織而首先被發(fā)現(xiàn)的。TLRs在天然免疫和獲得性(適應(yīng)性)免疫誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。TLRs廣泛表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞,也可表達(dá)于一些組織器官細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞可表達(dá)TLR1~TLR4和TLR6。TLRs亦可表達(dá)于腎小球細(xì)胞。例如TLR4 mRNA可以在足細(xì)胞、鮑曼氏囊和系膜細(xì)胞表達(dá)[9]。

    TLRs(除TLR3)與病原體分子配體結(jié)合后可通過形成二聚體激活下游信號分子MyD88[10]。在靜止?fàn)顟B(tài)下,IκBα和NF-κB結(jié)合而抑制NF-κB,使NF-κB在細(xì)胞質(zhì)中處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)MyD88被活化后可激活I(lǐng)KKβ,從而導(dǎo)致IκBα的素化而從IκB/NF-κB復(fù)合物中釋放出來,NF-κB由此活化并轉(zhuǎn)位入核,從而激活一系列致炎因子基因如IL-6、CCL3、CCL4、CCL5、ICAM1、CD80、TNF-α和IL-12b等的表達(dá)[11-12]。TLR3則可通過MyD88依賴性信號通路激活NF-κB。

    近年研究發(fā)現(xiàn)TLRs與腎臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)[13]。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎小球腎炎中TLR7和TLR9表達(dá)顯著升高[14]。TLR2和TLR4在缺血再灌注腎損傷中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)TLR2基因缺失的小鼠可以免受功能性和組織性局部缺血的損害[15]。TLR1和TLR9在去鐵鐵蛋白(Apoferritin)誘導(dǎo)的腎炎中表達(dá)升高,且發(fā)現(xiàn)TLR9多態(tài)性和人類多種疾病包括IgA腎病相關(guān)[16]。研究發(fā)現(xiàn),TLR3配體可以通過NF-κB信號通路誘導(dǎo)CD80在人類腎臟足細(xì)胞的表達(dá)[17]。TLR2和TLR4在糖尿病腎病中發(fā)揮重要作用,特別是在高脂飲食的大鼠糖尿病模型中,TLR4和其下游的IKKβ/NF-κB通路明顯被激活[18-20]。但是,目前對TLRs系統(tǒng)在衰老腎臟中的作用尚不清楚。

    本研究首次系統(tǒng)地分析了在大鼠腎臟衰老過程中TLRs信號通路分子、NF-κB信號通路分子以及炎癥因子CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF-α和IL-12b的表達(dá)變化情況,發(fā)現(xiàn)在衰老腎臟中TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR11的表達(dá)顯著升高,而TLR6、TLR7和TLR10則未見明顯變化。隨后檢測了TLRs信號通路下游分子MyD88表達(dá),發(fā)現(xiàn)在衰老腎臟中MyD88水平也顯著升高。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控各種促炎因子表達(dá)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子,已發(fā)現(xiàn)TLR活化后可以激活NF-κB信號通路。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在衰老腎臟中NF-κB信號通路分子IκBα、NF-κB與Phospho-NF-κB表達(dá)明顯升高,相應(yīng)地,也發(fā)現(xiàn)在衰老腎臟組織中促進(jìn)炎癥因子CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF-α和IL-12b的表達(dá)明顯上調(diào)。這些結(jié)果顯示TLRs系統(tǒng)可能通過激活NF-κB信號通路、促進(jìn)炎癥因子表達(dá)而在腎臟衰老過程中發(fā)揮重要作用。

    近年研究表明免疫炎癥可能與衰老相關(guān)性疾病的發(fā)生有關(guān)。已發(fā)現(xiàn)在老年人群體內(nèi)炎癥因子如TNF-α、IL-6、C-反應(yīng)蛋白的血清水平顯著增加,但是對炎癥通過什么機(jī)制參與組織器官衰老則不太清楚。本研究顯示TLRs系統(tǒng)與腎臟器官衰老的發(fā)生密切相關(guān),這為今后進(jìn)一步明確腎臟衰老的機(jī)制提供了一種新方向。

    [1]Wang CY,Cusack JC,Liu R,et al.Control of inducible chemoresistance:enhanced anti-tumor therapy through increased apoptosis by inhibition of NF-kappaB[J].Nat Med,1999,5(4):412-417.

    [2]Kleinridders A,Schenten D,Konner AC,et al.MyD88 signaling in the CNS is required for development of fatty acid-induced leptin resistance and diet-induced obesity[J].Cell Metab,2009,10(4):249-259.

    [3]Takeuchi O,Akira S.Pattern recognition receptors and inflammation[J].Cell,2010,140(6):805-820.

    [4]Cai W,He JC,Zhu L,et al.Oral glycotoxins determine the effects of calorie restriction on oxidant stress,age-related diseases,and lifespan[J].Am J pathol,2008,173(2):327-336.

    [5]Baylis C.Changes in renal hemodynamics and structure in the aging kidney;sexual dimorphism and the nitric oxide system[J].Expl gerontol,2005,40(4):271-278.

    [6]Davalos AR,Coppe JP,Campisi J,et al.Senescent cells as a source of inflammatory factors for tumor progression[J].Cancer Metastasis Rev,2010,29(2):273-283.

    [7]Coresh J,Selvin E,Stevens LA,et al.Prevalence of chronic kidney disease in the United States[J].JAMA,2007,298(17):2038-2047.

    [8]Lee EJ,Schmittgen TD.Comparison of RNA assay methods used to normalize cDNA for quantitative real-time PCR[J].Anal Biochem,2006,357(2):299-301.

    [9]Brown HJ,Lock HR,Wolfs TG,et al.Toll-like receptor 4 ligation on intrinsic renal cells contributes to the induction of antibody-mediated glomerulonephritis via CXCL1 and CXCL2[J].J Am Soc Nephrol,2007,18(6):1732-1739.

    [10]Anderson KV.Toll signaling pathways in the innate immune response[J].Curr Opin Immunol,2000,12(1):13-19.

    [11]Kawai T,Akira S.Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors[J].Trends Mol Med,2007,13(11):460-469.

    [12]Judge S,Jang YM,Smith A,et al.Age-associated increases in oxidative stress and antioxidant enzyme activities in cardiac interfibrillar mitochondria:implications for the mitochondrial theory of aging[J].FASEB J,2005,19(3):419-421.

    [13]Robson MG.Toll-like receptors and renal disease[J].Nephron Exp Nephrol,2009,113(1):e1-7.

    [14]Smith KD.Toll-like receptors in kidney disease[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2009,18(3):189-196.

    [15]Leemans JC,Stokman G,Claessen N,et al.Renal-associated TLR2 mediates ischemia/reperfusion injury in the kidney[J].J Clin Invest,2005,115(10):2894-2903.

    [16]Lafyatis R,Marshak RA.Toll-like receptors and innate immune responses in systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Res Ther,2007,9(6):222.

    [17]Shimada M,Ishimoto T,Lee PY,et al.Toll-like receptor 3 ligands induce CD80 expression in human podocytes via an NF-kappaBdependent pathway[J].Nephrol Dial Transplant,2012,27(1):81-89.

    [18]Lin M,Yiu WH,Wu HJ,et al.Toll-like receptor 4 promotes tubular inflammation in diabetic nephropathy[J].J Am Soc Nephrol,2012,23(1):86-102.

    [19]Li F,Yang N,Zhang L,et al.Increased expression of toll-like receptor 2 in rat diabetic nephropathy[J].Am J Nephrol,2010,32(2):179-186.

    [20]Milanski M,Degasperi G,Coope A,et al.Saturated fatty acids produce an inflammatory response predominantly through the activation of TLR4 signaling in hypothalamus:implications for the pathogenesis of obesity[J].J Neurosci,2009,29(2):359-370.

    猜你喜歡
    月齡腎臟分子
    保護(hù)腎臟從體檢開始
    中老年保健(2022年3期)2022-08-24 02:58:10
    3種冠狀病毒感染后的腎臟損傷研究概述
    分子的擴(kuò)散
    湖州33月齡男童不慎9樓墜落上海九院對接“空中120”成功救治
    提高育肥豬出欄率合理的飼養(yǎng)密度
    哪些藥最傷腎臟
    憑什么要捐出我的腎臟
    特別健康(2018年9期)2018-09-26 05:45:46
    不同月齡荷斯坦牛產(chǎn)奶量的研究
    “精日”分子到底是什么?
    新民周刊(2018年8期)2018-03-02 15:45:54
    米和米中的危險分子
    波多野结衣一区麻豆| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 老司机靠b影院| av在线app专区| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 一级毛片电影观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 免费少妇av软件| 国产毛片在线视频| 亚洲精品美女久久av网站| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产精品偷伦视频观看了| 国产国语露脸激情在线看| 国产亚洲最大av| 日韩欧美精品免费久久| 三上悠亚av全集在线观看| 国产精品国产av在线观看| 男女之事视频高清在线观看 | 亚洲色图综合在线观看| 另类精品久久| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 搡老乐熟女国产| 久久精品久久精品一区二区三区| 99久久99久久久精品蜜桃| 无限看片的www在线观看| www日本在线高清视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美黑人精品巨大| 母亲3免费完整高清在线观看| 中国三级夫妇交换| 咕卡用的链子| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲成人av在线免费| 十八禁人妻一区二区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产av码专区亚洲av| 最黄视频免费看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 秋霞在线观看毛片| av视频免费观看在线观看| 在线看a的网站| 日日撸夜夜添| 高清欧美精品videossex| 九九爱精品视频在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 观看美女的网站| 99热全是精品| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 在线观看免费高清a一片| 老汉色∧v一级毛片| 欧美黄色片欧美黄色片| 日本一区二区免费在线视频| 好男人视频免费观看在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产探花极品一区二区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久 成人 亚洲| 美女视频免费永久观看网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 最新的欧美精品一区二区| svipshipincom国产片| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲成人免费av在线播放| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久久国产一级毛片高清牌| 丰满少妇做爰视频| 天天影视国产精品| 男的添女的下面高潮视频| 国产男人的电影天堂91| 曰老女人黄片| 欧美黑人精品巨大| 成人手机av| 青春草亚洲视频在线观看| 青春草国产在线视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 美女大奶头黄色视频| 国产精品三级大全| 亚洲欧美激情在线| 91精品三级在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 成人漫画全彩无遮挡| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产又色又爽无遮挡免| 国产成人精品福利久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黑人猛操日本美女一级片| 国产成人a∨麻豆精品| 秋霞在线观看毛片| 人妻一区二区av| 久久99精品国语久久久| av在线播放精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美激情极品国产一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美精品av麻豆av| 婷婷成人精品国产| 国产探花极品一区二区| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品久久久久成人av| av在线老鸭窝| 久久久亚洲精品成人影院| 一边亲一边摸免费视频| 一级黄片播放器| 亚洲欧美成人精品一区二区| 观看av在线不卡| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 成年av动漫网址| 色网站视频免费| 国产一区亚洲一区在线观看| 日韩一区二区三区影片| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产亚洲欧美精品永久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产av一区二区精品久久| 超色免费av| 两个人看的免费小视频| 丝袜在线中文字幕| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 久久精品国产亚洲av涩爱| 欧美日韩福利视频一区二区| 超碰成人久久| 亚洲国产精品999| av免费观看日本| 国产1区2区3区精品| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品三级大全| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产伦人伦偷精品视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲成人av在线免费| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲四区av| 国产精品久久久人人做人人爽| 免费高清在线观看视频在线观看| 我的亚洲天堂| a 毛片基地| 亚洲欧美色中文字幕在线| 中文天堂在线官网| 日本av手机在线免费观看| 久久久久久人妻| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 超碰97精品在线观看| 五月开心婷婷网| 国产成人免费观看mmmm| 制服人妻中文乱码| 一区二区三区激情视频| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品 欧美亚洲| 日本av手机在线免费观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美在线黄色| av免费观看日本| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲综合精品二区| 1024香蕉在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产精品久久久久成人av| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 操出白浆在线播放| 国产精品免费视频内射| 精品少妇黑人巨大在线播放| 大片电影免费在线观看免费| 国产亚洲av高清不卡| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 成人国产麻豆网| 在现免费观看毛片| 大香蕉久久网| 成人国产av品久久久| 国产有黄有色有爽视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 波多野结衣av一区二区av| 这个男人来自地球电影免费观看 | 久久人妻熟女aⅴ| 久久久久精品国产欧美久久久 | 9色porny在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产成人精品无人区| 制服人妻中文乱码| 亚洲欧美色中文字幕在线| 又大又爽又粗| 不卡av一区二区三区| 久久天堂一区二区三区四区| 桃花免费在线播放| 国产成人欧美| 国产福利在线免费观看视频| 国产成人a∨麻豆精品| 男人添女人高潮全过程视频| 成人手机av| 一级毛片我不卡| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产极品天堂在线| 黄色毛片三级朝国网站| 美女午夜性视频免费| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 人妻人人澡人人爽人人| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 激情视频va一区二区三区| 国产av精品麻豆| 欧美精品av麻豆av| 在线观看一区二区三区激情| 婷婷色综合大香蕉| 久热爱精品视频在线9| 看十八女毛片水多多多| 国产精品女同一区二区软件| 伊人久久国产一区二区| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲四区av| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲精品乱久久久久久| 九九爱精品视频在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 久久97久久精品| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 男人操女人黄网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品第一国产精品| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久久鲁丝午夜福利片| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产成人a∨麻豆精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| 精品午夜福利在线看| 妹子高潮喷水视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 无限看片的www在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| xxx大片免费视频| 亚洲精品国产区一区二| 视频在线观看一区二区三区| av不卡在线播放| 成年人免费黄色播放视频| 午夜激情久久久久久久| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 久久久久精品久久久久真实原创| 激情视频va一区二区三区| 天堂中文最新版在线下载| 日本av手机在线免费观看| 国产淫语在线视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲,一卡二卡三卡| 久热这里只有精品99| 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品一区二区精品视频观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 日本av手机在线免费观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 99热国产这里只有精品6| 久久久久国产精品人妻一区二区| 免费观看人在逋| 天堂8中文在线网| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲精品乱久久久久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 超色免费av| 在现免费观看毛片| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 色视频在线一区二区三区| 精品国产一区二区三区四区第35| av片东京热男人的天堂| 晚上一个人看的免费电影| 母亲3免费完整高清在线观看| 99九九在线精品视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产男人的电影天堂91| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 日韩伦理黄色片| 亚洲五月色婷婷综合| 久久精品人人爽人人爽视色| 97精品久久久久久久久久精品| 国产有黄有色有爽视频| 热re99久久国产66热| 熟女av电影| av网站在线播放免费| 成年av动漫网址| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 男女免费视频国产| 咕卡用的链子| 老司机影院毛片| 亚洲情色 制服丝袜| 午夜福利乱码中文字幕| 国产一区亚洲一区在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲av男天堂| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 水蜜桃什么品种好| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 美女中出高潮动态图| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美日韩av久久| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 啦啦啦在线免费观看视频4| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲精品一区蜜桃| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 自线自在国产av| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品偷伦视频观看了| 最近2019中文字幕mv第一页| 男女免费视频国产| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 999精品在线视频| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲精品日本国产第一区| 大陆偷拍与自拍| 久久精品久久精品一区二区三区| 日本黄色日本黄色录像| av在线播放精品| 一本一本久久a久久精品综合妖精| av一本久久久久| 一区福利在线观看| 国产精品免费大片| 精品人妻在线不人妻| 午夜激情久久久久久久| avwww免费| 精品午夜福利在线看| 丝袜喷水一区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲av男天堂| av在线老鸭窝| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 91成人精品电影| 精品久久久久久电影网| 国产在线一区二区三区精| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲熟女毛片儿| 色精品久久人妻99蜜桃| 最近2019中文字幕mv第一页| av网站免费在线观看视频| 亚洲四区av| 黄频高清免费视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美激情高清一区二区三区 | 午夜福利网站1000一区二区三区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产福利在线免费观看视频| 欧美日韩精品网址| 1024视频免费在线观看| 青春草国产在线视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久精品久久久久久久性| 十八禁人妻一区二区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久性视频一级片| 妹子高潮喷水视频| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品久久久久久久久免| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲专区中文字幕在线 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 桃花免费在线播放| 国产免费又黄又爽又色| 夫妻午夜视频| 亚洲精品一二三| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲在久久综合| 久久青草综合色| 啦啦啦 在线观看视频| 久久97久久精品| 美女高潮到喷水免费观看| 国产99久久九九免费精品| 亚洲国产日韩一区二区| 大片免费播放器 马上看| 国产高清不卡午夜福利| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 大陆偷拍与自拍| 一本久久精品| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美精品亚洲一区二区| 这个男人来自地球电影免费观看 | 午夜老司机福利片| 亚洲精品一区蜜桃| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 视频区图区小说| 乱人伦中国视频| 亚洲av男天堂| 青春草视频在线免费观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 人妻 亚洲 视频| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品久久久人人做人人爽| 搡老乐熟女国产| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 丁香六月欧美| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 另类精品久久| 午夜老司机福利片| 夫妻性生交免费视频一级片| 最近手机中文字幕大全| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲精品第二区| 成人手机av| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 日日撸夜夜添| 在线观看免费视频网站a站| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 大片免费播放器 马上看| 精品国产乱码久久久久久男人| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 十八禁高潮呻吟视频| 日韩大片免费观看网站| 午夜福利乱码中文字幕| 久久久久久久久免费视频了| 国产成人精品福利久久| 婷婷色综合www| 人成视频在线观看免费观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 最黄视频免费看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 尾随美女入室| 中文字幕高清在线视频| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产 一区精品| 韩国精品一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 国产精品国产av在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产免费现黄频在线看| 在线 av 中文字幕| 又大又爽又粗| 国产爽快片一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 啦啦啦 在线观看视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 午夜福利网站1000一区二区三区| 韩国高清视频一区二区三区| 久久久久精品久久久久真实原创| 天天影视国产精品| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 黄色一级大片看看| 免费日韩欧美在线观看| 97在线人人人人妻| 国产激情久久老熟女| 国产毛片在线视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 男的添女的下面高潮视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产国语露脸激情在线看| 在线观看一区二区三区激情| 国产精品一区二区在线不卡| 成人亚洲精品一区在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 日韩大码丰满熟妇| 男人舔女人的私密视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产成人免费无遮挡视频| 男女之事视频高清在线观看 | 建设人人有责人人尽责人人享有的| 观看av在线不卡| tube8黄色片| 久久ye,这里只有精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 精品少妇黑人巨大在线播放| 午夜福利影视在线免费观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲图色成人| 国产精品三级大全| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 麻豆av在线久日| 老司机靠b影院| 亚洲精品乱久久久久久| 黄片小视频在线播放| 嫩草影院入口| 中文天堂在线官网| 中文字幕制服av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲男人天堂网一区| 午夜91福利影院| 一级片免费观看大全| 久久久久久人人人人人| 午夜激情久久久久久久| 老汉色av国产亚洲站长工具| 热99国产精品久久久久久7| 国产精品成人在线| 丝袜喷水一区| 久久综合国产亚洲精品| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久人人爽人人片av| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 人妻 亚洲 视频| 在线观看免费高清a一片| 欧美在线一区亚洲| 久久久久久人人人人人| 大片电影免费在线观看免费| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲天堂av无毛| 国产又爽黄色视频| 色视频在线一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品二区激情视频| 亚洲四区av| 成人黄色视频免费在线看| 搡老岳熟女国产| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 丝袜美腿诱惑在线| 久久精品久久久久久久性| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲欧美清纯卡通| 久久99精品国语久久久| 波多野结衣av一区二区av| 91老司机精品| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 热re99久久精品国产66热6| 国产成人欧美在线观看 | 欧美精品一区二区免费开放| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 51午夜福利影视在线观看| 老司机靠b影院| 国产亚洲欧美精品永久| 成人免费观看视频高清| 97精品久久久久久久久久精品| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲欧美清纯卡通| 男人操女人黄网站| 久久狼人影院| 在线观看免费高清a一片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 男女午夜视频在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲精品在线美女| 国产男人的电影天堂91| 亚洲中文av在线| 免费黄色在线免费观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日本午夜av视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 精品国产国语对白av| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产又爽黄色视频| 国产1区2区3区精品| 婷婷色麻豆天堂久久| av在线老鸭窝| 国产av国产精品国产| 日韩av在线免费看完整版不卡| 丁香六月天网| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 美女大奶头黄色视频| 日日啪夜夜爽| 国产一区二区 视频在线| 大话2 男鬼变身卡| 免费黄网站久久成人精品| 国产高清国产精品国产三级| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产成人精品久久久久久| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产成人精品久久久久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久热在线av| 亚洲精品aⅴ在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 黄色怎么调成土黄色|