電針對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬膽堿能神經(jīng)元的影響

張海燕 劉忠錦 廉 潔 陳志偉

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院組胚教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161006

阿爾茨海默病（AD）是一種多病因產(chǎn)生的漸進(jìn)性腦功能障礙疾病。主要是在大腦海馬區(qū)域出現(xiàn)淀粉樣物質(zhì)，即淀粉樣β蛋白（amyloidβprotein，Aβ），Aβ可以使組織產(chǎn)生大量自由基，干擾鈣離子代謝，膽堿能系統(tǒng)損傷，從而引起腦神經(jīng)元發(fā)生改變[1-2]。衡量膽堿能神經(jīng)元功能的標(biāo)志是乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（CHAT），它是乙酰膽堿（ACh）生物合成的關(guān)鍵酶。本研究觀察側(cè)腦室注射Aβ1-40所致AD模型大鼠的腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶（AchE）及CHAT的影響，對(duì)AD的藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康Wistar大鼠48只，雄性，體重（250±50）g，白求恩醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)2010002，經(jīng)水迷宮測(cè)試篩選48只，隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、加蘭他敏組和電針組，正常組常規(guī)飲水和飼料。其余3組大鼠均注射β-淀粉樣肽（1-40）（Aβ1-40）所致AD模型，模型組造模后不治療。加蘭他敏組采用氫溴酸加蘭他敏灌胃0.5～1 mg/（kg·d），治療4周。參照實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[3]，電針組針刺百會(huì)、雙腎俞、雙足三里、大椎等穴治療，用0.25mm×0.25mm華佗牌無菌毫針針刺，連接DJ-6805型脈沖電針儀，電壓為2 V，頻率為20 Hz，強(qiáng)度以肢體局部輕微顫動(dòng)為度，持續(xù)刺激20 min，每日1次，連續(xù)治療4周。

1.1.2 主要試劑和儀器 氫溴酸加蘭他敏（陜西森弗生物技術(shù)有限公司），Aβ1-40（Sigma公司），AchE、CHAT免疫組化檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），AchE及CHAT測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、腦立體定位儀、水迷宮、DJ-6805型脈沖電針儀，Olympus顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 模型復(fù)制 10%水合氯醛4 mL/kg麻醉大鼠，在頭部做正中矢狀切口，坐標(biāo)為腦表面下3.5mm，前囟1.5mm，矢狀縫左右旁開1.5mm。在每側(cè)側(cè)腦室注射，緩慢注入二甲亞砜孵育72 h后的聚集態(tài)Aβ1-40（5μg/μL）各2μL，創(chuàng)口縫合。

1.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)[4]，定位航行試驗(yàn)（place navigation test）：從治療結(jié)束后第1天開始，歷時(shí)5 d，每天分上、下午各2次，分別從4個(gè)不同的入水點(diǎn)，將大鼠于象限邊緣1/2弧度處頭朝池壁放入水中，記錄其2 min內(nèi)尋找平臺(tái)所需時(shí)間（逃避潛伏期）。若大鼠入水后2 min內(nèi)未能找到平臺(tái)，則將其置于平臺(tái)上并停留10 s，引導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶，逃避潛伏期記錄為120 s?？臻g探索試驗(yàn)（spatial probe test）：實(shí)驗(yàn)第6天撤除平臺(tái)，將大鼠面向池壁從任一入水點(diǎn)放入水池，測(cè)試2 min內(nèi)跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.2.3 取材 實(shí)驗(yàn)完成后，每組取6只大鼠麻醉后，打開胸腔暴露出心臟，左心室插入灌注針頭，快速灌入無菌生理鹽水，剪開右心耳，待右心耳處流出澄清液體，然后灌注4%多聚甲醛，當(dāng)大鼠尾巴、四肢僵硬時(shí)斷頭取腦，分離海馬。一側(cè)海馬裝入凍存管，一側(cè)置于4%多聚甲醛中，浸泡固定，取海馬標(biāo)本，脫水包埋切片。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色大鼠海馬 AchE和CHAT的表達(dá)采集免疫組化染色圖像，用Image-Pro Plus分析軟件進(jìn)行圖像分析，每張切片區(qū)10個(gè)視野測(cè)定海馬組織中陽性細(xì)胞數(shù)和平均灰度值，陽性表達(dá)越強(qiáng)，平均灰度值越低。所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.2.5 考馬斯亮蘭法大鼠AchE及CHAT活性測(cè)定 各組取6只大鼠迅速斷頭處死，取腦，制成10%腦勻漿，然后將制備好的腦勻漿以3000 r/min離心10 min，取上清液適量，其中蛋白測(cè)定采用考馬斯亮蘭法測(cè)定，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。最后用光度計(jì)測(cè)定各管吸光度，計(jì)算AchE及CHAT的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料SPSS 17.0系統(tǒng)處理，數(shù)計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠海馬AchE和CHAT的表達(dá)

大鼠海馬神經(jīng)元模型組，AchE染色物平均灰度值明顯降低，表明模型組AchE陽性細(xì)胞數(shù)量增加，與正常組、加蘭他敏組和電針組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但模型組CHAT平均灰度值升高，表明模型組CHAT陽性細(xì)胞數(shù)量減少，治療后加蘭他敏組和電針組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、2，圖1。

表1 三組大鼠海馬AchE表達(dá)的比較（±s，n=6）

表1 三組大鼠海馬AchE表達(dá)的比較（±s，n=6）

注：與模型組比較，＊P＜0.05

組別 海馬AchE陽性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/高倍視野）海馬AchE陽性染色物平均灰度值正常組模型組加蘭他敏組電針組6.86±2.35＊17.31±3.79 11.07±3.42＊11.42±3.41＊177.38±5.69＊148.15±3.47 167.23±4.85＊166.75±4.92

表2 三組大鼠海馬CHAT表達(dá)的比較（±s，n=6）

表2 三組大鼠海馬CHAT表達(dá)的比較（±s，n=6）

注：與模型組比較，＊P＜0.05

組別 海馬CHAT陽性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/高倍視野）海馬CHAT陽性染色物平均灰度值正常組模型組加蘭他敏組電針組19.25±4.16＊7.04±2.18 14.25±3.62＊13.72±3.41＊143.56±3.82＊179.31±5.24 153.94±4.26＊158.48±4.63＊

圖1 免疫組化海馬CHAT表達(dá)（×400）

2.2 考馬斯亮蘭法大鼠海馬AchE和CHAT含量的測(cè)定

模型組AchE含量增加，提示AchE活性增強(qiáng)，加蘭他敏組和電針組AchE含量下降，模型組與正常組、加蘭他敏組和電針組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但模型組CHAT含量下降，CHAT活性減弱，低于加蘭他敏組和電針組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 電針對(duì)海馬AchE和CHAT含量的影響（IU/g，±s，n=6）

表3 電針對(duì)海馬AchE和CHAT含量的影響（IU/g，±s，n=6）

注：與模型組比較，＊P＜0.05

組別 海馬AchE含量 海馬CHAT含量正常組模型組加蘭他敏組電針組123.6215±9.8532＊348.2593±13.0672 185.5739±10.6821＊183.9637±10.2684＊257.8546±5.9750＊81.8543±4.6528 205.7539±5.9732＊202.5637±5.3695＊

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)將阿爾茨海默病歸于“呆病”、“文癡”、“善忘”、“癲證”、“狂證”等癥范疇，癡呆病位在腦，與心、脾、肝、腎等密切相關(guān)，而腎精氣虧虛、髓海不足為其根本原因[5]，治療應(yīng)以補(bǔ)腦髓，暢活氣血為主。百會(huì)位于巔頂針刺此穴可補(bǔ)益腦髓，寧神開竅之功；腎俞為腎臟氣血輸注之處，為治療腎虛、腦髓不足的要穴。故取腎俞可針對(duì)AD之本虛，補(bǔ)腎生髓益智。電針腎俞能改善衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[6]。足三里為足陽明胃經(jīng)合穴，脾胃為后天之本，針此穴有扶正培元之功；大椎為督脈之穴，具有統(tǒng)領(lǐng)一身之陽氣，聯(lián)絡(luò)一身之陰氣的作用。而督脈是與腦聯(lián)系最直接、最密切的經(jīng)脈，還聯(lián)系心、腎二臟。所以刺激大椎穴就有調(diào)節(jié)陰陽、疏經(jīng)通絡(luò)，行氣活血、祛邪扶正的作用[7]。故而，百會(huì)、足三里、腎俞、大椎四穴合用，能標(biāo)本兼顧，共同改善AD的臨床癥狀。

研究表明AD患者神經(jīng)生化方面的改變?yōu)楹ｑR中Ach含量的顯著減少，CHAT活性降低，AchE活性增高。而記憶障礙與膽堿能遞質(zhì)缺乏密切相關(guān)，膽堿神經(jīng)功能明顯下降，并且其臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度與膽堿能系統(tǒng)功能的損害程度相關(guān)[8-9]。AchE的活性變化能反映Ach在腦組織中分解率的變化，AchE的作用是將Ach水解成膽堿和乙酸；相反的，CHAT的活性變化反映Ach在腦組織中合成率的變化。AchE和CHAT二者的共同作用維持著腦組織中Ach含量的動(dòng)態(tài)平衡，反映了Ach的代謝速率[10-12]。AchE參與膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，當(dāng)接受到外界刺激時(shí)，在鈣離子的參與下，囊泡與突觸前膜相融合，釋放Ach至突觸間隙。然后Ach作用于突觸后膜的Ach受體，介導(dǎo)信息的傳遞，參與學(xué)習(xí)記憶功能的完成[13]。電針可明顯改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和腦組織形態(tài)學(xué)異常，可能與減輕自由基損傷、提高腦ACh含量、抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[14]等有關(guān)。

本研究觀察了大鼠海馬組織中AchE和CHAT的表達(dá)和活性，發(fā)現(xiàn)AD模型大鼠中海馬AchE陽性細(xì)胞表達(dá)明顯升高，CHAT陽性細(xì)胞明顯降低，同時(shí)AchE活性升高，CHAT活性降低，這與AD的膽堿能學(xué)說相符[15]。通過電針和氫溴酸加蘭他敏治療后AchE陽性細(xì)胞表達(dá)下降，CHAT陽性細(xì)胞增加。本研究說明電針治療可抑制AchE的表達(dá)，提高CHAT的表達(dá)，促進(jìn)Ach的合成，抑制Ach的分解，增加腦組織的Ach含量，從而改善學(xué)習(xí)記憶力能力。提示電針通過調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)元的表達(dá)和含量變化，促進(jìn)受損神經(jīng)的恢復(fù)和再生。

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