乳糜池結(jié)扎對(duì)大鼠急性胰腺炎肺損傷的影響

張大鵬，李 陽，崔乃強(qiáng)，王 豐

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）時(shí)，腸黏膜破壞引起細(xì)菌移位、腸源性內(nèi)毒素血癥，通過門脈系統(tǒng)、淋巴途徑，常造成遠(yuǎn)隔器官損傷，尤以肺損傷最為常見[1-2]。肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)可在一定程度上清除門脈系統(tǒng)中的細(xì)菌、內(nèi)毒素，而腸淋巴可通過胸導(dǎo)管直接到達(dá)肺臟。乳糜池是胸導(dǎo)管起始處的膨大部，收集乳糜和來自全身的大部分淋巴[3]。本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠AP模型的基礎(chǔ)上，研究乳糜池結(jié)扎對(duì)急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 雨蛙素（Sigma 公司），大鼠IL-1、ICAM-1、Ang-2 ELISA 試劑盒（Cusabio 公司），髓過氧化物酶測(cè)試盒（南京建成），考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒（南京建成）。

1.2 模型制備及分組 選取健康雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量250～300 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供(編號(hào)SCXK 京2005- 0013)。隨機(jī)分為4 組，每組10只，即A組（假手術(shù)組）、B組（AP組）、C組（乳糜池結(jié)扎組）、D 組（乳糜池結(jié)扎加AP 組）。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉，固定，備皮消毒，行正中開腹手術(shù)。C、D組通過乳糜池結(jié)扎阻斷腸淋巴回流，A、B組予剖腹手術(shù)后關(guān)腹。48 h后，C、D組采用皮下注射雨蛙素50 μg·Kg-1·h-1的方法建立AP模型，A、B組予等量生理鹽水，連續(xù)6次。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) 術(shù)后48 h 記錄大鼠存活率。各組大鼠于造模后6 h處死，解剖游離出右主支氣管，結(jié)扎，2 mL 生理鹽水進(jìn)行肺泡灌洗。5 min 后緩慢吸出，共2次?；厥章?0%以上。將2次灌洗液放入同一離心管，離心（1500×g，10 min，4 ℃），將離心管上清液分裝，-80 ℃冰箱保存。

肺臟組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)測(cè)定 采用酶化學(xué)法，按試劑盒（南京建成生物研究所提供）說明操作。

肺泡灌洗液蛋白測(cè)定 采用考馬斯亮蘭法，按試劑盒（南京建成生物研究所提供）說明操作。

大鼠肺泡灌洗液白介素1（interleukin-1，IL-1）、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管生成素-2（angiopoietin-2，ANG-2）測(cè)定 采用ELISA法，按試劑盒（Cusabio公司提供）說明操作。

1.4 病理學(xué)檢查 取大鼠胰腺、右肺組織及末端回腸，置于10%福爾馬林中固定，石蠟切片，HE 染色，光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述、數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析(one-way ANVOVA)，多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較采 用LSD(Least Significant Difference)。P ＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后存活率 A、B兩組與C、D兩組比較，術(shù)后48 h存活率無顯著性差異。見表1。

表1 各組大鼠術(shù)后存活率

2.2 肺臟MPO 水平 肺臟MPO 水平：A、C、D 組顯著低于B組，D組顯著高于C組，P＜0.05。見表2。

表2 各組大鼠肺臟MPO水平（mean±SD，U/g）

2.3 肺泡灌洗液蛋白含量測(cè)定 肺泡灌洗液蛋白含量,B、C、D 組顯著高于A 組，D 組顯著低于B 組，P＜0.05。如表3。

表3 各組大鼠肺泡灌洗液蛋白含量（mean±SD，g/L）

2.4 肺泡灌洗液IL-1、ICAM-1、Ang-2 水平 肺泡灌洗液IL-1 水平比較, B、D 組顯著高于A、C 組，P＜0.05；肺泡灌洗液ANG-2水平比較, D組顯著低于B組，P＜0.05。如表4。

表4 各組大鼠肺泡灌洗液IL-1、ICAM-1、ANG-2水平比較（mean±SD, pg/mL）

2.5 病理學(xué)檢查 B、C、D組胰腺、末端回腸間質(zhì)不同程度水腫伴炎細(xì)胞浸潤。B、D 組肺間質(zhì)水腫，肺泡壁斷裂、融合，肺泡腔內(nèi)可見炎細(xì)胞浸潤，但D 組較B組損傷明顯減輕。A、C組無明顯病理變化。見圖1～圖3。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理表現(xiàn)(HE×200)

圖2 各組大鼠回腸病理表現(xiàn)(HE×200)

3 討論

圖3 各組大鼠肺組織病理表現(xiàn)(HE×200)

急性胰腺炎時(shí)常因肺部炎癥、肺毛細(xì)血管通透性增加而造成肺損傷[4]。多形核白細(xì)胞（polymorphonuclear, PMN）在炎癥反應(yīng)中起著重要的作用，構(gòu)成宿主的第一道免疫防線，但PMN的過度激活將會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。MPO是PMN聚集的特征酶，可用于評(píng)估其浸潤程度。在制備大鼠AP模型6 h后，肺組織MPO 水平顯著增高，存在PMN 的浸潤，肺部炎癥反應(yīng)。而乳糜池結(jié)扎可明顯降低肺組織MPO 水平，減少PMN浸潤，減輕肺部炎癥反應(yīng)。

PMN浸潤將破壞肺泡-毛細(xì)血管屏障，血管通透性增加，使富含蛋白的水腫液流入肺泡[5-6]。BALF中總蛋白含量的增加，是肺泡-毛細(xì)血管屏障破壞的重要標(biāo)志[7]。在制備大鼠AP模型6 h后，BALF蛋白含量增加，提示肺泡-毛細(xì)血管屏障的破壞。而乳糜池結(jié)扎可明顯減少BALF蛋白含量，減輕AP時(shí)肺泡-毛細(xì)血管屏障的破壞。

同時(shí)，一些炎癥介質(zhì)（細(xì)胞因子、趨化因子等）在PMN的激活、聚集過程中起著重要作用，將進(jìn)一步促進(jìn)PMN浸潤[8]。IL-1在炎癥早期產(chǎn)生，是一類最重要的促炎細(xì)胞因子，在肺損傷過程中發(fā)揮重要作用。在制備大鼠AP模型6 h后，BALF中IL-1水平明顯增高，提示AP時(shí)引起肺組織炎癥反應(yīng)。但乳糜池結(jié)扎并未減少IL-1水平，這可能是由于IL-1在炎癥早期產(chǎn)生，在炎癥發(fā)展過程中，肺泡內(nèi)含量已趨于穩(wěn)定。

ICAM-1可介導(dǎo)PMN黏附，在其滲出、游走和浸潤過程中發(fā)揮重要作用，參與炎癥反應(yīng)。而且，一些細(xì)胞因子（如IL-1）可上調(diào)ICAM-1 的表達(dá)[9]。本實(shí)驗(yàn)在制備大鼠AP模型6 h后，BALF中ICAM-1水平并未明顯增高，但存在上升趨勢(shì)，乳糜池結(jié)扎后存在ICAM-1 水平下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)采用雨蛙素誘導(dǎo)的AP 模型為水腫型胰腺炎，ICAM-1 高表達(dá)出現(xiàn)較晚。

ANG-2是一種血管生長(zhǎng)因子，可選擇性作用于血管內(nèi)皮，導(dǎo)致血管破壞，增加血管滲漏。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Ang-2與炎癥之間存在聯(lián)系，可上調(diào)內(nèi)皮對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)在制備大鼠AP 模型6 h 后，BALF 中ANG-2 水平并未明顯增高，但存在上升趨勢(shì)，而乳糜池結(jié)扎可明顯降低AP 大鼠BALF中ANG-2水平，減輕肺損傷。這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)采用雨蛙素誘導(dǎo)的AP 模型為水腫型胰腺炎，ANG-2高表達(dá)出現(xiàn)較晚。

在試驗(yàn)中選用雨蛙素造模，形成大鼠水腫性胰腺炎模型，因此胰腺病理僅觀察到胰腺組織水腫和炎性細(xì)胞浸潤，而無胰腺實(shí)質(zhì)性壞死。模型組所形成的肺損害也相對(duì)重型胰腺炎為輕。但由于輕型胰腺炎造模具有方法簡(jiǎn)便且存活時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，因此在本次試驗(yàn)中被采用。

采用乳糜池結(jié)扎方法阻斷腸淋巴回流，大鼠恢復(fù)48 h 后通過雨蛙素誘導(dǎo)法制備AP 模型，將手術(shù)應(yīng)激對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響降低到最小。AP 早期即可出現(xiàn)肺組織損傷性病理形態(tài)學(xué)變化。腸淋巴阻斷可通過減少PMN聚集，減輕肺部炎癥反應(yīng)，來保護(hù)肺泡-毛細(xì)血管屏障，從而減輕AP引起的肺損傷。實(shí)驗(yàn)中未進(jìn)行淋巴液外引流，其目的為了觀察淋巴回流受阻對(duì)回腸的病理學(xué)影響。回腸的病理學(xué)檢查結(jié)構(gòu)顯示，急性胰腺炎造模及對(duì)乳糜池的結(jié)扎均對(duì)回腸產(chǎn)生間質(zhì)水腫的影響。實(shí)驗(yàn)中也觀察到，淋巴回流受阻的大鼠其糞便軟化并顏色變淺。因此，腸淋巴途徑可能是腸道與肺臟產(chǎn)生病理生理學(xué)交互影響的紐帶，為“肺與大腸相表里”由腸及肺途徑的作用提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。但是腸淋巴中具體何種物質(zhì)引起肺損傷，以及肺損傷的發(fā)病機(jī)制，還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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