新型高效液相色譜流動相手性添加劑法拆分頭孢氨芐對映體

沈靜茹，王 偉，余學(xué)紅，蔡 薇，張 祎,劉武林

(1 中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院分析化學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430074；2 中南民族大學(xué) 校醫(yī)院，武漢 430074)

頭孢氨芐是一種半合成的第一代口服頭孢霉素類抗生素藥物，可通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成而殺滅細(xì)菌，在臨床上廣泛用于敏感菌所致多種呼吸道、泌尿道等感染的治療[1]，但是有些人對頭孢氨芐有不良過敏反應(yīng)如休克，哮喘，皮疹等[2]，這類常見抗生素的對映體分離研究應(yīng)能有助于更好地推進(jìn)研究其藥效學(xué)和藥代動力學(xué).頭孢氨芐的定量檢測方法有液質(zhì)(LC-MS)法[3],流體注射化學(xué)發(fā)光法[4]等.蘇立強(qiáng)等[5]采用高效液相色譜-手性流動相添加劑(HPLC-CMPA)法分離頭孢氨芐得到一對對映體的分離.但頭孢氨芐結(jié)構(gòu)(見圖1)[6]中有3個手性碳，在β-內(nèi)酰胺環(huán)上2個手性C1、C2共平面，這一剛性結(jié)構(gòu)使其與C3形成2對對映體，而這4個對映異構(gòu)體的分離，未見相關(guān)分離報道.近年來，HPLC-CMPA法拆分手性藥物使用的手性包合試劑中環(huán)糊精類添加劑較為普遍，其中常用的手性流動相是環(huán)糊精(CD)類衍生物，如羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)、三甲基-β-環(huán)糊精(TM-β-CD)、羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD)、陽離子-β-環(huán)糊精(Cationic-β-CD)、磺丁基醚-β-環(huán)糊精(SBE-β-CD)等[7].

圖1 頭孢氨芐結(jié)構(gòu)式

本文將曾用于模擬酶催化[8]或抑制[9]領(lǐng)域的雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-CD(簡稱β-CD-C2)[10]作為HPLC流動相添加劑手性分離頭孢氨芐，此衍生物制備簡單，改善了β-環(huán)糊精的溶解性和立體選擇性，多個羧基官能團(tuán)與頭孢氨芐作用位點(diǎn)更豐富，還可在水中溶解成弱酸與三乙胺溶液形成緩沖體系，無需另加緩沖溶液控制酸度恒定.以乙腈-添加劑緩沖溶液作為流動相，ODS-BP柱為固定相，在最佳條件下進(jìn)行手性分離，可實(shí)現(xiàn)頭孢氨芐4個對映異構(gòu)體色譜峰的基線分離，為頭孢氨芐的手性分離提供了新的拆分方法和體系.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

乙腈(色譜純,天津市科密毆化學(xué)試劑有限公司)，雙-[6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-CD)(自制)，三乙胺(分析純，上海金山亭化工試劑廠)，超純水(美國Moleculer超純水機(jī)生產(chǎn))，頭孢氨芐膠囊(浙江亞太藥業(yè)股份有限公司)，頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所).

P230-II高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)，pHS-3C 型酸度計(上海偉業(yè)儀器廠)，0.22μm 微孔濾膜(上海市新亞凈化器件廠).

1.2 色譜條件

色譜柱：SinoChrom ODS-BP(4.6mm×150mm)(大連依利特分析儀器有限公司)；流動相︰添加劑緩沖液(V(添加劑水溶液)︰V(三乙胺)=11︰4)-乙腈；檢測波長：310 nm；樣品濃度：2.3 mmol/L；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：20 ℃；流速：0.6 mL/min.

1.3 藥品前處理

頭孢氨芐配制成28.75mmol/L儲備液，據(jù)實(shí)驗(yàn)需要配成不同濃度，進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾.將不同濃度市售純度為99.5％的三乙胺加入一系列不同濃度的β-CD-C2配制成添加劑緩沖液，經(jīng)0.22μm的水系膜過濾脫氣;色譜純乙腈過濾脫氣，備用.

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相乙腈與緩沖液的影響

2.1.1 乙腈-緩沖液溶解度范圍測試

β-CD-C2-三乙胺緩沖液與有機(jī)調(diào)節(jié)劑乙腈存在溶解度控制的問題，在20℃，6.0 mmol/L添加劑，不同酸度時乙腈與添加劑在不同配比下的溶解度考察結(jié)果如表1所示.由表1可見，6.0 mmol/L添加劑條件下，當(dāng)V(乙腈)︰V(添加劑)大于5︰5時，添加劑比例越大越不易沉淀，說明有機(jī)相越多，添加劑越易析出，越易沉淀.當(dāng)V(乙腈)︰V(添加劑)小于5︰5(分別為4︰6，3︰7，2︰8，1︰9)時，無明顯沉淀，不同pH值影響不大.

表1 添加劑在乙腈中的溶解度

2.1.2 乙腈-緩沖液配比變化對頭孢氨芐分離的影響

以O(shè)DS-BP柱為固定相，β-CD-C2添加劑緩沖液(pH 8.4)-乙腈作為手性流動相，流速：0.6 mL/min，檢測波長：310 nm，樣品濃度：2.3 mol/L，進(jìn)樣量：20 μL，在乙腈體積分?jǐn)?shù)為45％～15％變化范圍內(nèi)對頭孢氨芐4個對映體進(jìn)行手性分離，分離結(jié)果如圖2所示.由圖2可見，隨著流動相中乙腈體積分?jǐn)?shù)的減小，添加劑緩沖液體積分?jǐn)?shù)的增大，分離度呈上升趨勢，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)降為25％時，最難分離的第1、2對映異構(gòu)體之間開始分離，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)達(dá)20％時分離度最大，Rs為3.25，此時1、2、3、4 四個對映異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)了基線分離，且此時流動相整體洗脫強(qiáng)度也最佳.之后隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的減小，分離狀況和洗脫強(qiáng)度都減弱，故選擇乙腈-緩沖液體積比為20︰80最適.

a～d)乙腈和添加劑緩沖液體積比分別為：35︰65；25︰75；20︰80；15︰85

2.2 流動相緩沖液pH值對頭孢氨芐分離的影響

以O(shè)DS-BP柱為固定相，3 mmol/Lβ-CD-C2添加劑-三乙胺緩沖液和乙腈作為手性流動相，V(緩沖液)︰V(乙腈)=80︰20，流速：0.6 mL/min，檢測波長：310 nm，樣品濃度：2.3mmol/L，進(jìn)樣量：20 μL，通過改變添加劑與三乙胺體積來調(diào)節(jié)pH使之分別為8.4,8.6,8.8,9.0時對頭孢氨芐進(jìn)行手性分離，得到一系列分離結(jié)果見圖3.

a)pH=8.4；b)pH=8.6；c)pH=8.8；d)pH=9.0

由圖3可見，在pH 8.4～9.0時頭孢氨芐均有分離跡象，其中較難拆分1和2兩對映體，隨著pH的增大分離度逐漸加大，到pH 8.8時，1和2對映體拆分接近基線，同時1、2、3、4 四個對映體實(shí)現(xiàn)基線分離，且洗脫強(qiáng)度最佳，綜合4個對映體的峰形、洗脫強(qiáng)度、分離效果等因素，選擇8.8為最適pH.

2.3 流動相添加劑濃度對頭孢氨芐分離的影響

以O(shè)DS-BP柱為固定相，通過改變添加劑濃度分別為1,3,5,7,9 mmol/L ,用等濃度的三乙胺溶液分別調(diào)節(jié)為pH 8.8的緩沖液，以乙腈和β-CD-B2添加劑緩沖液作為手性流動相(V(乙腈)︰V(緩沖液)=20︰80)，流速：0.6 mL/min，檢測波長：310 nm，樣品濃度：2.3m mol/L，進(jìn)樣量：20 μL，考察其對頭孢氨芐手性分離的影響，結(jié)果見圖4.由圖4可見，以較難分離的1、2對映體為考察對象，當(dāng)β-CD-C2存在時，頭孢氨芐Rs>2.05；當(dāng)濃度為5 mmol/L時，峰洗脫強(qiáng)度大、對稱性好，分離度可達(dá)到Rs為4.93；隨著β-CD-C2濃度的增大，對稱性和分離度有所下降，同時當(dāng)添加劑濃度大于10 mmol時易在乙腈中析出，綜合考慮選擇5 mmol/L為最適添加劑濃度.

c/(mmol·L-1)

2.4 對比試驗(yàn)

因β-CD-C2的合成是在雙(-6-氧-丁烯二酸單酯)-β-環(huán)糊精(β-CD-A2)中間產(chǎn)物上用氯乙酸通過加成反應(yīng)得到的，故對比試驗(yàn)選擇用純環(huán)糊精和中間體，與添加劑最佳條件下分離情況進(jìn)行比對.以O(shè)DS-BP柱為固定相，在pH 8.8，乙腈與緩沖液體積比為20︰80的最佳條件下，以濃度為5.0 mmol/L的β-CD，β-CD-A2，β-CD-C2分別為HPLC的流動相添加劑和乙腈體系分離頭孢氨芐，同時對比了β-CD-C2和溶劑水(圖5c)，結(jié)果見圖5.如圖5a所示，β-CD對頭孢氨芐有一定分離跡象，但峰洗脫強(qiáng)度小，雜質(zhì)峰較多且基線不穩(wěn)；圖5b中β-CD-A2的加入使4個對映體有了分離跡象，但洗脫強(qiáng)度不大，峰形對稱性不好；圖5c中β-CD-C2作為流動相添加劑時，在最佳條件下，不僅洗脫強(qiáng)度大，同時使頭孢氨芐的4個對映體達(dá)到基線分離.說明對β-CD進(jìn)行官能團(tuán)修飾后生成直鏈帶4個羧基的衍生物β-CD-C2與頭孢氨芐中的羥基能產(chǎn)生氫鍵和π-π共軛等協(xié)同作用，使得頭孢氨芐各單一對映體能與手性添加劑β-CD-C2形成復(fù)合物，在適宜的HPLC體系中實(shí)現(xiàn)分離.

a)β-CD；b)β-CD-A2；1)β-CD-B2；2)溶劑水

3 結(jié)語

頭孢氨芐是人畜最常用的抗生素之一，不可避免會在動物制品，人體血漿、腎臟等有殘留，對食品安全和人體健康帶來危害[11]，目前對頭孢氨芐的檢測主要是以消旋體形式的含量檢測，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜導(dǎo)致對映體分離困難，對映體含量檢測也鮮見文獻(xiàn)報道，本文是用新型HPLC流動相添加劑雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精作為手性流動相添加劑，建立了高效液相色譜手性拆分頭孢氨芐的新方法，為單一對映體含量測定提供了可能.考察了流動相配比、pH值、手性流動相添加劑β-CD-C2濃度等因素對手性分離的影響，在pH 8.8，5 mmol/Lβ-CD-C2緩沖液中進(jìn)樣20 μL，V(乙腈)︰V(緩沖液)=20︰80，檢測波長310 nm的最佳條件下，頭孢氨芐2對對映體實(shí)現(xiàn)了基線分離，4個對映體色譜峰均達(dá)到基線分離，最佳條件下4峰中相鄰2峰分離度Rs分別為3.41、5.34和8.93.

[1]賈亮平,張琰圖,齊廣才,等.高效液相色譜化學(xué)發(fā)光法檢測人體血清中的頭孢氨芐和甲氧芐啶[J].分析化學(xué),2009,37(z1):99.

[2]Lina Kantiani,Marinella Farre,Josep Manuel ,et al.Development and validation of a pressurized liquid extraction liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry method forβ-lactams and sulfonamides in animal feed [J].J Chromatogr A,2010(1217):4247-4254.

[3]Cai Shengwu,Jin Lanzhang,Yan Lingqiao,et al.Simultaneous determination of 14β-lactam antibiotics in cosmetic products by liquid chromatography tandem mass spectrometry method[J].J Chromatogr B,2006(832):307-312.

[3]Sun Y,Tang Y,Yao H,et al.Potassium permanganate-glyoxal chemiluminescence system for flow injection analysis of cephalosporin antibiotics: cefalexin,cefadroxil and cefazolin sodium in pharmaceutical preparations[J].Talanta,2004,64(1):156-159.

[4]蘇立強(qiáng),李 沖,張曉紅,等.高效液相色譜流動相添加劑法拆分頭孢氨芐對映體[J].藥物分析雜志,2008,28(6):921-923.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010: 208-209.

[6]尤啟冬,林國強(qiáng).手性藥物研究與評價[M].2版.北京: 化學(xué)工業(yè)出版社,2011:200-201.

[7]楊曉為,宋發(fā)軍,沈靜茹,等.β-CD衍生物的反膠束微型反應(yīng)器模擬酶催化氧化研究[J].分子催化,2002,16(2):111-115.

[8]徐 勇,伍 明,吳士筠,等.β-環(huán)糊精衍生物對α-羥丁酸脫氫酶的抑制作用[J].中南民族大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2005,24(1):21-23.

[9]丁志剛,羅天順,宋發(fā)軍,等.環(huán)糊精衍生物的合成及對脲酶的抑制作用[J].催化學(xué)報,1996,17(6):567-569.

[10]倪梅林,崔曉美,殷居易,等.動物組織與水產(chǎn)品中頭孢氨芐殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測[J].分析測試學(xué)報,2009,28(4):489-492.