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    綠原酸對體外培養(yǎng)成骨細胞活性的影響

    2013-12-22 08:10:59王朝元易繼凌魏甜甜唐俊龍楊光忠
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)箱促進作用成骨細胞

    王朝元,易繼凌,宋 超,魏甜甜,唐俊龍,楊光忠

    (1 中南民族大學 生命科學學院,武漢430074;2中南民族大學 藥學院,武漢430074)

    接骨草(Sambucuschinensis)為忍冬科接骨木屬,又名陸英、杜仲.主要分布于華北、華南、陜西、甘肅、四川、寧夏等省區(qū).接骨草的根、莖、葉、花和果實均可入藥,有祛風除濕、活血化瘀之功效.在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中,它可治療風濕疼痛、痢疾、黃疸、慢性氣管炎、風疹瘙癢、丹毒、跌打損傷和骨折[1,2],目前關(guān)于接骨草防治骨質(zhì)疏松和促進成骨細胞增殖的報道較多[3],但其促進骨折愈合的有效成分尚不清楚.

    綠原酸(chlorogenic acid ,CGA)是接骨草的化學成分之一,通常存在于杜仲、金銀花、葵花籽粕等植物中[4,5].現(xiàn)有研究表明:CGA具有廣泛的生理活性和藥理活性,如利膽、抗菌、降壓、增加白血球和興奮中樞系統(tǒng),抗腫瘤,清除自由基等[6-8].故本實驗以成骨細胞MC3T3-E1為體外模型,研究CGA對成骨細胞活性、ALP活性和成骨分化相關(guān)基因的影響,以闡明其是否具有促成骨作用,為接骨草的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù).

    1 材料和方法

    1.1 試劑和儀器

    CGA(SIGMA-ALDRICH公司),α-MEM培養(yǎng)基(Thermo賽默飛世爾生化制品有限公司),胎牛血清(杭州四季青公司),0.25%的胰蛋白酶(Thermo),青鏈霉素(Thermo),DMSO(Amresco,0231),MTT(Amerro),堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所),BCA蛋白試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo),SYBR Green熒光染料(日本TOYOBO公司).

    細胞培養(yǎng)瓶(美國Corning公司),96孔、24孔、6孔培養(yǎng)板(美國Corning公司),CO2培養(yǎng)箱(HF90/240型,利康生物醫(yī)療科技控股集團),倒置顯微鏡(Motic AE21型,重慶光學儀器),酶聯(lián)免疫分析儀(MULTISKAN ASCENT 354型,thermo),PCR儀(Biometra),凝膠成像分析儀(JS-380A,上海培清科技),熒光定量PCR儀(ABI,7500 fast).

    1.2 不同濃度CGA的制備

    稱取0.05g CGA溶于50 mL α-MEM培養(yǎng)基(無血清),配制成濃度為1 mg/mL的儲備液.再用含10%血清的α-MEM培養(yǎng)基將CGA儲備液倍比稀釋為11.02,22.05,44.09,88.19μmol/L等處理細胞.

    1.3 成骨細胞 MC3T3-E1的培養(yǎng)

    取液氮凍存的成骨細胞MC3T3-E1復蘇后,用含有10%胎牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)基,置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔3~4d更換1次培養(yǎng)基,待細胞90%鋪滿瓶底時,用0.25%的胰蛋白酶消化,按1︰2傳代培養(yǎng).

    1.4 CGA對成骨細胞增殖率的影響

    將生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1細胞以5×103/孔接種于96孔板中,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細胞貼壁后,分別加入含上述濃度CGA的培養(yǎng)基,設(shè)不加藥為對照組,每組5個復孔,分別培養(yǎng)0,1,3 d后,每孔分別加入20 μL MTT,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),反應(yīng)4 h,小心吸出上清液,每孔加入150 μL DMSO,吹打均勻后,在37℃培養(yǎng)箱中溫育10 min,使其紫色結(jié)晶完全溶解,用酶標儀在492nm波長處測定其OD值.

    1.5 CGA對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響

    將生長狀態(tài)良好的成骨細胞MC3T3-E1按105/孔接種到24孔板中,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待細胞貼壁后加入22.05,44.09 μmol/L藥物(該濃度下對成骨細胞增殖促進作用較好)設(shè)不加藥為對照組,每組3個復孔,分別培養(yǎng)2,4,6 d后,按照ALP試劑盒和BCA蛋白試劑盒的操作步驟測定細胞中ALP活性.

    1.6 CGA對成骨細胞成骨分化相關(guān)基因表達的影響

    將生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1細胞按2×105/孔接種到6孔板中,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待細胞貼壁后加入藥物,設(shè)不加藥為對照組,每組3個復孔,分別培養(yǎng)2,4,6 d后,用Trizol法提取總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,并進行real-time PCR.反應(yīng)條件:95℃,15s;60℃,15s;72℃,45s;40個循環(huán).以看家基因GAPDH為內(nèi)參,每個樣品設(shè)3個復孔,采用2﹣ΔΔCt法[9]檢測成骨分化相關(guān)基因的表達,不同骨相關(guān)基因PCR引物序列如見表1.

    表1 熒光定量PCR引物序列

    1.7 統(tǒng)計學處理

    根據(jù)公式F=2﹣[(待測組目的基因平均Ct值-待測組內(nèi)參基因平均Ct值)-(對照組目的基因平均Ct值-對照組內(nèi)參基因平均Ct值)],計算出目的基因的相對表達量.用單因素方差分析(one-way ANOVA)對結(jié)果進行顯著性差異分析.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 CGA對成骨細胞增殖的影響

    不同濃度CGA對成骨細胞增殖的影響結(jié)果見圖1.如圖1所示,CGA濃度為11.02~88.19μmol/L時,對成骨細胞的增殖均有較好的促進作用,選擇22.05,44.09 μmol/L兩個濃度用于后續(xù)實驗.

    1)control;2~5)依次為11.02,22.05,44.09,88.19μmol/L CGA

    2.2 CGA對成骨細胞ALP活性的影響

    CGA對成骨細胞ALP活性的影響見圖2.由圖2可見,培養(yǎng)2 d時,44.09 μmol/L的CGA能促進成骨細胞MC3T3-E1ALP活性的表達(P<0.01).培養(yǎng)4 d時,CGA對成骨細胞MC3T3-E1ALP活性無顯著影響(P>0.05).隨著培養(yǎng)時間的增加,培養(yǎng)至6d時,22.05、44.09 μmol/L CGA對成骨細胞ALP活性的影響具有抑制作用(P<0.05).

    1)control;2)22.05 μmol/L CGA;3)44.09 μmol/L CGA

    2.3 CGA對成骨細胞成骨分化相關(guān)基因mRNA表達的影響

    CGA對c-fos基因mRNA表達的影響見圖3.由圖3可見,培養(yǎng)2d時,2種濃度的CGA對c-fos基因的表達均有極顯著促進作用(P<0.01);4d時,44.09 μmol/L CGA對c-fos基因表達的影響逐漸由促進轉(zhuǎn)為抑制(P<0.05);6d時,22.05 μmol/L CGA對c-fos基因表達明顯抑制(P<0.01),呈時間依賴性.

    1)control;2)22.05 μmol/L CGA;3)44.09 μmol/L CGA

    CGA對c-jun基因表達的影響見圖4.由圖4可見,22.05 μmol/L CGA短期處理(2~4 d)不影響c-jun基因表達(P>0.05),長期處理(6 d)則表現(xiàn)為抑制作用(P<0.05).44.09 μmol/L CGA處理2 d可顯著促進c-jun基因表達(P<0.01),長期處理(4~6 d)則具有顯著的抑制作用(P<0.01).故CGA對成骨細胞c-jun基因表達亦呈明顯的時間依賴性.

    1)control;2)22.05 μmol/L CGA;3)44.09 μmol/L CGA 與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,n=3

    CGA對Runx2基因表達的影響見圖5.由圖5可見,其影響呈明顯的時間依賴性.22.05 μmol/L CGA培養(yǎng)2~4d時,對Runx2 基因的表達呈上調(diào)作用(P<0.01),至6 d時,則表現(xiàn)為強烈的抑制作用(P<0.01).44.09 μmol/L的CGA在短期處理(2d)時,顯著促進Runx2 基因的表達(P<0.01),但是隨著培養(yǎng)時間的延長,促進作用變成抑制(P<0.01)或沒有顯著影響(P>0.01).

    1)control;2)22.05 μmol/L CGA;3)44.09 μmol/L CGA

    如圖6所示,CGA對osterix基因表達的影響也具有明顯的時間依賴性.兩種濃度的CGA短期處理(2 d)時,均極顯著地促進Osterix基因的表達(P<0.01).隨著培養(yǎng)時間的增加(4~6 d),兩種濃度的CGA處理對成骨細胞osterix表達的促進作用顯著減弱,直至抑制作用(P<0.01).

    1)control;2)22.05 μmol/L CGA;3)44.09 μmol/L CGA

    如圖7顯示,與CGA對ALP基因表達的影響與osterix基因類似,也具有明顯的時間依賴性.培養(yǎng)2 d,2種濃度的CGA均促進ALP基因的表達(P<0.05); 4~6 d時,2種濃度的CGA對ALP基因的表達均具有不同程度的抑制(P<0.05).

    1)control;2)22.05 μmol/L CGA;3)44.09 μmol/L CGA

    圖8中CGA對Col-I基因表達的影響也呈明顯的時間依賴性.但與CGA對Osterix和ALP基因表達的影響相反,隨著培養(yǎng)時間的延長,CGA對Col-I基因表達的促進作用增強.在2~6 d,22.05 μmol/L CGA對Col-I基因表達的影響由抑制轉(zhuǎn)為促進(P<0.01);而44.09 μmol/L的CGA對Col-I基因表達的影響始終具有促進作用(P<0.05),隨著培養(yǎng)時間的增加,促進作用愈發(fā)顯著(P<0.01).

    1)control;2)22.05 μmol/L CGA;3)44.09 μmol/L CGA

    3 討論

    MC3T3-E1細胞系是由C57BL/6小鼠顱骨細胞建株的成骨細胞,具有堿性磷酸酶活性,I型膠原合成和基質(zhì)鈣化等成骨細胞的生物學特性,常作為骨代謝研究的細胞模型[10].故本研究以MC3T3-E1細胞系來探討CGA對成骨細胞增殖及活性的影響.

    本實驗中,11.02~ 88.19 μmol/L的CGA在不同的時間點對成骨細胞的增殖均具有一定的促進作用,以22.05,44.09 μmol/L的CGA在2個濃度的CGA進行進一步研究.

    ALP的表達是成骨細胞分化早期的主要特征之一,是成熟成骨細胞的標志,其活性的高低可反映成骨細胞的活性狀況[11].故本文研究了CGA對ALP活性的影響.在2~6 d,隨著處理時間的延長,22.05 μmol/L CGA對ALP活性的影響由不影響變?yōu)橐种疲?4.09 μmol/L CGA對成骨細胞ALP活性的影響則由促進變?yōu)橐种?,并與隨后的CGA對ALP基因表達的影響結(jié)果一致.說明CGA對成骨細胞ALP活性的調(diào)控主要通過對其mRNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控來實現(xiàn).

    Runx2是干細胞向成骨細胞早期分化的重要標志基因,高表達Runx2可激活骨鈣蛋白、骨橋蛋白和骨涎蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達,從而促進成骨細胞成熟[12].Osterix是一種成骨細胞特異性表達的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子,對成骨細胞的分化起著重要作用.Osterix轉(zhuǎn)錄受Runx2正性調(diào)控,直接促進前成骨細胞向成骨細胞分化.Osterix能調(diào)控許多重要成骨細胞晚期表型和功能蛋白的表達,如骨鈣蛋白、骨橋蛋白、骨涎蛋白及I型膠原[13].在本研究中,CGA對Runx2和Osterix基因的表達具有顯著的時間依賴性,短期處理可以促進Runx2和OsterixmRNA的表達,隨著處理時間的延長,則表現(xiàn)為抑制作用.這一結(jié)果說明CGA短期處理可能促進干細胞向成骨細胞的分化,而長期處理則不利于干細胞向成骨細胞的分化.

    十分有意義的是,CGA可以促進成骨細胞Col-I的表達.I型膠原蛋白是成骨細胞分泌的骨主要有機成分,是成骨細胞的分化標志之一[14].本實驗中,除了短期培養(yǎng)(2 d)時,低濃度(22.05μmol/L)的CGA對Col-I基因的表達具有一定抑制作用(P<0.05),4~6 d,CGA均能顯著促進Col-I基因的表達,并呈時間依賴性.說明合適濃度的CGA對成骨細胞成熟具有正向調(diào)控作用,有助于骨基質(zhì)的形成和骨生長.

    原癌基因c-fos產(chǎn)物與其他一些轉(zhuǎn)錄因子如c-jun表達的癌蛋白結(jié)合,形成活性蛋白-1(AP-1),進而調(diào)控其他基因的轉(zhuǎn)錄,導致一系列生物學效應(yīng)的產(chǎn)生,進而促進細胞的分裂增殖[15].在成骨細胞中,c-jun調(diào)控相關(guān)基因如骨鈣素、I型膠原、堿性磷酸酶和組蛋白轉(zhuǎn)錄[16],故c-jun是調(diào)節(jié)成骨細胞增殖分化的基因之一.本研究中,CGA對c-fos和c-jun表達影響具有一定的復雜性,尚需進一步的研究闡明其機理.

    綜上所述,CGA具有調(diào)控成骨細胞增殖和分化的能力,CGA可促進成骨細胞的增殖,抑制成骨細胞ALP活性;CGA長期處理不利于干細胞向成骨細胞的分化,它通過促進I型膠原的表達而促進骨成熟分化.故CGA具有一定的成骨活性,是接骨草的成骨活性成分之一.

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