細(xì)節(jié)對(duì)高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的探討

花素靜，楊 銘，梁 軍

(1.鄭州市獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450002; 2.商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，河南 商丘 476000)

高效液相色譜法(high performance liquid chromatographu,HPLC)又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等.高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析.該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)[1]36-38.

高效液相色譜法具有分離效果好、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、分析速度快等優(yōu)點(diǎn).在進(jìn)樣量為μL數(shù)量級(jí)的情況下，常規(guī)紫外檢測(cè)器的靈敏度可達(dá)0.01ng，并可以分析70%以上的有機(jī)化合物.大多數(shù)樣品在30 min內(nèi)可完成分析，甚至有些樣品在5min內(nèi)即可完成分析.此外，高效液相色譜法還具有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn).但進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)，從樣品處理到上機(jī)，每一個(gè)細(xì)節(jié)都要處理得當(dāng)，否則，就會(huì)造成分析結(jié)果相對(duì)偏差較大.依據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，含量測(cè)定的對(duì)照溶液和樣品供試溶液每份至少注樣2次，由全部結(jié)果(n>=4)求得平均值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)一般應(yīng)不大于1.5%[2]3. 本文以注射用青霉素鉀為試驗(yàn)樣品，操作嚴(yán)格依據(jù)2010年版《中華人民共和國獸藥典》一部標(biāo)準(zhǔn)[3]3，通過兩臺(tái)高效液相色譜儀間的比對(duì)試驗(yàn)，詳細(xì)分析說明該問題.

1 材料和方法

1.1 儀器

BP211d十萬分之一天平，北京塞多利斯天平有限公司.

1100高效液相色譜儀/VWD檢測(cè)器，安捷倫科技有限公司，配Aglient HC-C18(2)柱.

1200高效液相色譜儀/VWD檢測(cè)器，安捷倫科技有限公司，配Eclipse XDB-C18柱.

1.2 試劑

青霉素對(duì)照品(K0251206，92.7%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；注射用青霉素鉀(2.5 g∶400萬單位)；乙腈(HPLC級(jí))；無水磷酸二氫鉀(優(yōu)級(jí)純)；超純水.

1.3 檢驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

流動(dòng)相：0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液∶乙腈(70∶30，用磷酸調(diào)pH至2.5)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長：225 nm；柱溫：26 ℃.

1.3.2 處理步驟

1.3.2.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱取青霉素對(duì)照品0.05 g兩份分別至100 mL容量瓶，各加少許超純水，輕搖使標(biāo)準(zhǔn)品充分溶解，繼續(xù)加入高純水至刻度線附近，用一次性滴管定容至刻度，上下振搖量瓶使充分混勻，得兩份終濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

樣品溶液：精密稱取注射用青霉素鉀樣品0.05 g兩份分別至100 mL容量瓶，各加少許超純水，輕搖使標(biāo)準(zhǔn)品充分溶解，繼續(xù)加入高純水至刻度線附近，用一次性滴管定容至刻度，上下振搖量瓶使充分混勻，得兩份終濃度為0.5 mg/mL的樣品溶液.

1.3.2.2 過濾與上機(jī)

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取規(guī)格為1 mL的一次性注射器，從一份標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取1 mL，直接分別注入兩個(gè)樣品瓶中，每個(gè)樣品瓶中約0.5 mL溶液，擰緊瓶蓋，將兩瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在兩臺(tái)高效液相色譜儀上按照色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，另一份標(biāo)準(zhǔn)品溶液同上分別注入兩個(gè)樣品瓶中，分別在兩臺(tái)高效液相色譜儀上按照色譜條件進(jìn)行檢測(cè).

樣品溶液：取規(guī)格為1 mL的一次性注射器，從一份樣品溶液中吸取1mL，通過一個(gè)針筒式濾膜過濾器，連續(xù)分別過濾至兩個(gè)樣品瓶中，每個(gè)樣品瓶中約0.5 mL溶液，擰緊瓶蓋，將兩瓶樣品溶液分別在兩臺(tái)高效液相色譜儀上按照色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，另一份樣品溶液同上分別注入兩個(gè)樣品瓶中，分別在兩臺(tái)高效液相色譜儀上按照色譜條件進(jìn)行檢測(cè).

2 結(jié)果

測(cè)試結(jié)果如圖1、2.

圖1 Aglient 1100圖譜

圖2 Aglient 1200圖譜

依據(jù)兩臺(tái)高效液相色譜儀顯示主要參數(shù)結(jié)果計(jì)算檢測(cè)樣品含量，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，公式如下:

A——試樣溶液對(duì)應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值；Ms——標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量(g)；

Cs——青霉素標(biāo)準(zhǔn)品的純度(%)；D——試樣稀釋倍數(shù)；

As——青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值；M——試樣質(zhì)量(g)；

Ds——青霉素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)；平均裝量——經(jīng)檢測(cè)，其值為2.5077 g.

每臺(tái)儀器檢測(cè)含量結(jié)果取兩樣平均值，結(jié)果如表1所示.

表1 兩臺(tái)高效液相色譜儀檢測(cè)參數(shù)及計(jì)算含量結(jié)果

通過檢測(cè)結(jié)果及計(jì)算發(fā)現(xiàn)兩臺(tái)儀器的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差較大(為1.8%).

3 原因分析

3.1 青霉素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品分解因素

藥物中青霉素檢測(cè)的處理方法簡單，故開始便在青霉素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品分解上找原因.一直認(rèn)為青霉素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品易分解，如在配制時(shí)間不一致、不同時(shí)間進(jìn)樣，可能會(huì)因標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的分解程度不一而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差過大.后通過同時(shí)配制標(biāo)準(zhǔn)品、同時(shí)配制樣品、同時(shí)進(jìn)樣，并將其中1瓶標(biāo)準(zhǔn)品在4個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)樣6次，發(fā)現(xiàn)青霉素基本未分解，結(jié)果比第一次略好一些，但是差別非常小，通過檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)相對(duì)偏差仍然較大(為1.6%)，相關(guān)圖譜及數(shù)據(jù)見圖3及表2所示，故而排除青霉素分解的因素.

圖3 同一瓶對(duì)照品四個(gè)小時(shí)內(nèi)所有圖譜的疊加圖譜

3.2 儀器間的影響

排除青霉素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品分解因素影響后，我們懷疑儀器間的相對(duì)偏差.但通過將一臺(tái)儀器上的同一瓶標(biāo)準(zhǔn)品、同一瓶樣品在另一臺(tái)儀器上進(jìn)樣，計(jì)算結(jié)果顯示，相對(duì)偏差在可控范圍內(nèi)(0.11%)，說明并不是儀器的原因,方法如上述外標(biāo)法計(jì)算，具體數(shù)值如下表3所示.

表2 同一瓶對(duì)照品四個(gè)小時(shí)內(nèi)峰面積響應(yīng)值

表3 兩臺(tái)高效液相色譜儀檢測(cè)參數(shù)及計(jì)算含量結(jié)果

3.3 一次性注射器及一次性濾膜過濾器吸附效應(yīng)的影響

在排除青霉素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品分解因素、儀器間的影響因素后，我們開始在樣品處理步驟上找原因.思前慮后，比較所有樣品瓶間的處理，我們認(rèn)定整個(gè)樣品處理過程只是在過濾環(huán)節(jié)有所不同，具體來說就是我們用注射器及濾膜過濾的樣品先裝一進(jìn)樣瓶后，又用同一注射器及同一濾膜過濾再次過濾樣品分裝于另一進(jìn)樣瓶.通過查閱相關(guān)資料得知，一方面因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)使用的一次性注射器及濾膜過濾器，其材質(zhì)為塑料及有機(jī)系尼龍，吸附能力非常強(qiáng)，吸附了溶液中的溶質(zhì)，另一方面相當(dāng)于第一次過濾時(shí)注射器及濾膜沒浸潤，而第二次過濾時(shí)相當(dāng)于已浸潤.因此，即使用同一注射器及同一濾膜過濾同一樣品時(shí)，其吸附及浸潤(稀釋)因素對(duì)結(jié)果可能影響很大.

4 改進(jìn)措施

針對(duì)上述可能導(dǎo)致結(jié)果相對(duì)偏差過大因素，重新稱量青霉素對(duì)照品與樣品，重新同時(shí)溶解、定容對(duì)照品與樣品溶液，用1mL一次性注射器吸取溶液，通過一個(gè)一次性濾膜裝入一個(gè)樣品瓶中后，換注射器與濾膜，繼續(xù)裝瓶，每個(gè)樣品瓶中的溶液體積約為1mL.同時(shí)在兩臺(tái)高效液相色譜儀上進(jìn)行檢測(cè).

5 改進(jìn)后結(jié)果

經(jīng)過改進(jìn)后，兩臺(tái)高效液相色譜儀檢測(cè)到的含量相對(duì)偏差在可控范圍內(nèi)(0.13%)，結(jié)果如表4所示，有明顯改善.

表4 兩臺(tái)高效液相色譜儀檢測(cè)參數(shù)及計(jì)算含量結(jié)果

6 結(jié)論

第一，由于青霉素水溶液的半衰期短，因此在做青霉素類藥物檢測(cè)時(shí)，對(duì)照品溶液及樣品溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)用、同步進(jìn)行處理，才可以從根本上保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性.

第二，對(duì)于高效液相色譜的紫外檢測(cè)器，其氘燈能量與使用時(shí)間有很大關(guān)系，如果氘燈使用時(shí)間超出使用壽命，其能量可能不足，從而對(duì)檢測(cè)結(jié)果的正確性帶來不確定因素.

第三，樣品處理過程中的細(xì)節(jié)問題必須考慮.本文出現(xiàn)的問題，其實(shí)是很小的細(xì)節(jié)問題，但其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響卻是很大的.一次性注射器及尼龍針筒式濾膜過濾器，適用范圍廣，可應(yīng)用于絕大多數(shù)有機(jī)溶液及無機(jī)溶液的過濾.由于塑料及尼龍濾膜對(duì)溶質(zhì)的吸附(稀釋)作用現(xiàn)在還沒有較全面的資料介紹，故而在日常的含量檢測(cè)中，必須取相同體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品溶液通過濾膜過濾器.本文試驗(yàn)證明，就是這個(gè)貌似不起眼的細(xì)節(jié)，大大影響了檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性與準(zhǔn)確性.

[1] 高效液相色譜法[J].北方園藝,2012(21).

[2] 獸藥檢驗(yàn)操作規(guī)程[S].中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,2005.

[3] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典(一部)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2011.