三疣梭子蟹增養(yǎng)殖過程對野生種群的遺傳影響
——以海州灣為例

董志國 ，李曉英，張慶起，閻斌倫，孫效文

(1.淮海工學院，江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室，連云港 222005;2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306;3.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150001;4.贛榆縣海洋漁業(yè)技術指導站，連云港 222100)

三疣梭子蟹(Portunus tritubeirculatus)是一種重要的海洋經(jīng)濟動物，隸屬甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)，是目前世界上最主要的捕撈蟹類。FAO 2010年數(shù)據(jù)顯示全世界三疣梭子蟹年捕撈產(chǎn)量超過38萬t［1］。中國海梭子蟹資源豐富，在過去幾十年，三疣梭子蟹的捕撈產(chǎn)量不斷增長，2010年我國梭子蟹海洋捕撈產(chǎn)量約為35萬t，隨著育苗技術和養(yǎng)殖技術的突破，養(yǎng)殖產(chǎn)量在2010年已達9.1萬t，養(yǎng)殖面積達3萬hm2［2］。海州灣位于江蘇連云港，是中國沿海三疣梭子蟹天然資源的主要漁場之一，但隨著1993年對蝦養(yǎng)殖病害大規(guī)模暴發(fā)，產(chǎn)量大幅度下降之后，海灣灣近岸開發(fā)以梭子蟹為主進行池塘養(yǎng)殖，建設了萬畝梭子蟹基地，并帶動周邊養(yǎng)殖面積達1700 hm2以上。作為主要的漁業(yè)資源，2009年增殖放流三疣梭子蟹583.9萬只，之后每年都有增殖放流活動。但近年來的大面積池塘養(yǎng)殖和增殖放流對野生資源的遺傳影響尚不明確，特別是放流親本的選擇及其遺傳背景均少有關注。已有研究表明，三疣梭子蟹的養(yǎng)殖群體與野生群體在繁殖性能上存在著明顯差異，在卵的孵化率、胚胎發(fā)育時間和幼體成活率方面野生三疣梭子蟹要優(yōu)于池塘養(yǎng)殖群體［3］。對大西洋鮭(Salmo salar L.)野生和養(yǎng)殖群體及其雜交后代研究表明蝦青素含量存在明顯的差異，且是由于遺傳因素影響所致［4］。對浙江三門養(yǎng)殖青蟹 (Scylla paramamosain)和野生青蟹的遺傳差異研究發(fā)現(xiàn)群體的遺傳多樣性均很高，但產(chǎn)生子一定程度的分化［5］。而對于三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體與野生群體的遺傳分析還未見報道，僅有三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體同工酶的組織特異性及生化遺傳分析的研究報復［6］。而且，近10年來，在海州灣開展三疣梭子蟹規(guī)?；B(yǎng)殖和近年開展的人工放流活動并存，但這些活動對天然資源的遺傳影響還未有研究報道，但增殖放流過程中對放流群體開展遺傳評價已成為一種常規(guī)和必須的任務［7］，但目前我國還很少有關注。因此，本研究利用SSR分子標記技術，探明近岸三疣梭子蟹養(yǎng)殖活動對天然資源的影響程度，對于漁業(yè)資源的評價、管理與保護具有重要的科學價值。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

試驗用三疣梭子蟹野生種群系2011年11月采集于海州灣自然海區(qū)，兩個養(yǎng)殖群體均采自海州灣所屬海頭鎮(zhèn)萬畝梭子蟹養(yǎng)殖基地，基地所用苗種均為連云港本地育苗場多年繁殖苗種后代，其親本為養(yǎng)殖蟹多代繁殖后代。3個群體均為當年商品蟹，雌雄隨機各30只。采集到的三疣梭子蟹活體運回實驗室，－70℃低溫冰箱保存。

1.2 DNA提取與PCR擴增、測序

取附肢肌肉組織約50 mg，先用蒸餾水將組織清洗干凈，按照常規(guī)的酚－氯仿法提取DNA［8］。擴增反應體系15μL，包括:2×PCR Mixture，正反向引物各0.2 pmoL/L、約100 ng基因組DNA。擴增程序為:94℃預變性4 min;94℃變性30 s，50—60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán);72℃延伸6 min，4℃保存。試驗所用微衛(wèi)星引物見表1。

表1 用于PCR擴增的20個三疣梭子蟹微衛(wèi)星分子標記Table 1 Characterization of twenty microsatellite loci in Portunus trituberculatus

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠檢測，電泳緩沖液為l×TBE(pH值8.0)，常溫電泳后銀染，顯色后于掃描儀下觀察并拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Gel－Pro analyzer對顯色后的SSR掃描電泳圖譜進行統(tǒng)計分析，每一個條帶視為一個位點，最高位點記作位點A，其次為B，以此類推;利用Pop32軟件計算等位基因頻率(N)、有效等位基因數(shù)(Ne)、期望雜合度(He)，觀察雜合度(Ho)并分析F統(tǒng)計量、基因流(Nm)、種群遺傳一致度(I)和遺傳距離(Ds)，并運用非加權算術平均法(UPGMA)對3個群體進行聚類分析;應用中LittleProgram計算多態(tài)信息含量(PIC);使用TPFGA程序構建系統(tǒng)發(fā)生樹;應用STATISTICA 99'對群體的遺傳參數(shù)進行單因子方差分析，并在進行0.05水平的Duncan檢驗。

2 結果與分析

2.1 海州灣三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體與野生群體的遺傳多樣性

20個微衛(wèi)星位點在3個三疣梭子蟹群體擴增結果列于表2，20個位點在3群體中的等位基因數(shù)為2—7，其中野生群體的平均等位基因數(shù)5，而兩個養(yǎng)殖群體的等位基因平均分別為3.35和2.9。根據(jù)Botstein等提出的衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(PIC)，20個位點除SZX14在野生群中具有較高的無效基因(null allele)外，其余均為高度多態(tài)位點，說明這20個微衛(wèi)星位點可以用于三疣梭子蟹種群遺傳學的研究［9］?；?0個微衛(wèi)星位點的3群體有效等位基因數(shù)(Ne)、期望雜合度(He)、觀察雜合度(Ho)以及PIC見圖1，顯示遺傳多樣性最高的是野生種群，Ho=0.8509，而兩養(yǎng)殖群體的雜合度低于野生群體，Ho分別為0.4525和0.5283。經(jīng)單因子方差分析顯示海州灣野生三疣梭子蟹的 Ne、Ho、He、PIC均顯著高兩養(yǎng)殖群體(P＜0.05)，但兩養(yǎng)殖群體的Ne、Ho、He、PIC均無顯著差異(P＞0.05)。以上結果說明海州灣天然三疣梭子蟹群體的遺傳多樣性顯著高于養(yǎng)殖群體。

2.2 海州灣三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體與野生群體的遺傳漸滲狀況

海州灣三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體與野生群體間的基因流(Nm)和遺傳分化指數(shù)Fst如表3所示。3群體的Fst為0.1085—0.1448，處于中度分化狀態(tài)，Nm處于1.5—2.0。野生群體與養(yǎng)殖群體的遺傳分化要較養(yǎng)殖群體內(nèi)部之間更大，基因流也較養(yǎng)殖群體內(nèi)部之間要小，表明野生群體與養(yǎng)殖群體存在一定的分化，基因流處于中等程度。

圖1 三疣梭子蟹群體遺傳信息差異Fig.1 Difference of genetic characterization of P.trituberculatus stocks

2.3 海州灣三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體與野生群體的遺傳系統(tǒng)關系

海州灣三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體與野生群體間的Nie's無偏遺傳距離見表4，結果顯示野生群體與養(yǎng)殖群體的遺傳距離較大，在0.5以上，而養(yǎng)殖群體間的遺傳距離為0.3223，說明野生群體與養(yǎng)殖群體具有一定的分化。圖2為三群體的聚類圖，養(yǎng)殖群體間的距離更近，聚類為一支，野生群作為獨立的一支。

3 討論

3.1 海州灣三疣梭子蟹的遺傳多樣性

圖2 海州灣三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體與野生群體的聚類分析圖Fig.2 Diagram of cluster analysis of cultured and wild stocks of P.trituberculatus in Haizhou Bay

表3 海州灣三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體與野生群體的遺傳分化與基因流Table 3 Fst and Gene flow of P.trituberculatus of cultured and wild stocks in Haizhou Bay

表4 海州灣三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體與野生群體的Nie's無偏遺傳距離Table 4 Nie's unbias genetic distancest and Gene flow of P.trituberculatus of culture and wild stocks in Haizhou Bay

中國自然海區(qū)三疣梭子蟹的遺傳多樣性相對比較豐富，大量的研究結果證實了這一結論［10－13］，但遺憾的是較少有人關注人工養(yǎng)殖和增殖放流對資源的遺傳影響，這可能與我國開展三疣梭子蟹養(yǎng)殖與人工放流時間較短有關，也與三疣梭子蟹標志物應用局限有關。本研究結果顯示20個位點在3群體中的等位基因數(shù)為2—7，其中野生群體的平均等位基因數(shù)5，而兩個養(yǎng)殖群體的等位基因平均分別為3.35和2.9，這一結果低于青蟹東海三門灣野生群體(9.83)與浙江三門養(yǎng)殖群體(6.23)［5］，但符合Liu等對黃渤海6個野生三疣梭子蟹群體的結果(2.5—6.5)［14］，這說明三疣梭子蟹等位基因數(shù)低于青蟹，可能與不同種類有關。海州灣三疣梭子蟹天然群體的遺傳多樣性都較高，Ho高達0.8509，略高于青島、東營、濰坊和日照野生群體的Ho值(0.71—0.83)［14］，而本研究中兩養(yǎng)殖群體的雜合度則低于上述黃渤海區(qū)野生群體，Ho分別為0.4525和0.5283，但養(yǎng)殖群體的雜合度略低于三門青蟹養(yǎng)殖與野生群體相近(H=0.56—0.58)。本研究結果顯示海州灣天然三疣梭子蟹群體的遺傳多樣性顯著高于養(yǎng)殖群體，但兩獨立的養(yǎng)殖群體的Ne、Ho、He、PIC均無顯著差異(P＞0.05)，這說明海州灣的野生資源遺傳多樣性較好，明顯好于養(yǎng)殖群體。這可能是由于人工養(yǎng)殖和增殖放流的效應時間還比較短，而養(yǎng)殖群體可能用于人工繁殖的有效親本相對較小，從而導致群體遺傳多樣性下降。而這種遺傳多樣性的差異存在，更提示了開展天然種質(zhì)資源保護的必要性，要采取措施防止養(yǎng)殖三疣梭子蟹進入到天然水環(huán)境，同時也要對增殖放流的繁殖群體采用野生捕撈的遺傳多樣性高的大群體進行繁殖，以避免由于有效繁殖群體過小產(chǎn)生遺傳漂變。另外，長期來講還需要加強養(yǎng)殖群體和天然群體的遺傳監(jiān)測。遺傳多樣性是生物進化和維持物種防止滅絕的根本，其大小程度代表了物種的進化潛力和環(huán)境的適應程度。國內(nèi)對野生動物遺傳多樣性的研究主要在瀕危物種中開展［15－16］，旨在通過分析其遺傳多樣性現(xiàn)狀，制定出更有效的保護措施，與前述眾多研究者所用AFLP和D－Loop分子標記的研究結果一致，海州灣三疣梭子蟹的遺傳多樣性較高，具有種質(zhì)保護與遺傳育種選育的潛力。

3.2 規(guī)?；B(yǎng)殖對海州灣三疣梭子蟹的遺傳漸滲

微衛(wèi)星標記具有多態(tài)性高，在基因組中隨機分布、共顯性遺傳以及檢測手段經(jīng)濟簡便等諸多優(yōu)點而成為分子群體遺傳學的首選研究手段［17］，特別是研究生物不居群的相互關系。Wilson通過微衛(wèi)星標記技術研究斑驢蚌(Dreissena bugensis)引入到加拿大勞倫湖的種群擴散模式時發(fā)現(xiàn)斑驢蚌從引入點到大湖(Great Lake)最低處這一過程是以跳躍式為擴散途徑，已有的資料顯示為漸進式擴散，顯示出該種貝類具有多種擴散模式，而在對斑馬蚌的研究中則顯示為跳躍式擴散［18］。Therriault應用微衛(wèi)星標記研究了原產(chǎn)于北黑海Dnieper和Bug Limans的斑驢蚌引入途徑證實該貝是以跳躍式擴散的，是由商船經(jīng)伏爾加河系引入到加拿大勞倫湖的［19］。在對大量外來入侵種的群體擴散研究中發(fā)現(xiàn)外來種的大部分擴散是以長距離跳躍擴散而非漸進式擴散［20］。本文研究海州灣三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體與野生群體間Fst間于0.1085—0.1448間，說明處于中度分化狀態(tài)，Nm處于1.5—2.0間，而野生群體與養(yǎng)殖群體的遺傳分化要較養(yǎng)殖群體內(nèi)部之間更大，基因流也較養(yǎng)殖群體內(nèi)部之間要小，表明野生群體與養(yǎng)殖群體存在一定的分化，基因流處于中等程度。這一結果其實與作者用AFLP和D－Loop分子標記的對中國沿海6個地理種群結果基本一致，處于中等分化程度［21］。說明野生群體與養(yǎng)殖群體的遺傳交流處于中等程度，但養(yǎng)殖群體與野生群體的分化，特別是養(yǎng)殖群體遺傳多樣性低于野生群體，這也意味著在海州灣開展人工增殖放流是一定要有足夠的有效繁殖親本，且用于放流的三疣梭子蟹應來自當?shù)匾吧Y源。但對中華絨螯蟹，表明人工選育中華絨螯蟹群體與長江水系天然群體間沒有發(fā)生顯著性遺傳分化［22］，這在育種來講是非常理想的。但本研究結果顯示出野生和養(yǎng)殖群體三疣梭子蟹的遺傳差異，提示了人們要更加注意養(yǎng)殖群體對野生群體的遺傳影響。采用線粒體DNA COI基因序列對厚殼貽貝2個養(yǎng)殖群體與2個野生群體的遺傳多樣性研究顯示:在養(yǎng)殖群體中單倍型的數(shù)量和遺傳多樣性要比野生群體的低，養(yǎng)殖群體與當?shù)匾吧后w之間也未發(fā)生顯著的遺傳分化［23］，這一結果與本研究所得結果一致?？傊嗨笞有佛B(yǎng)殖群體與野生群體存在的遺傳差異，這可能與海州灣人工養(yǎng)殖三疣梭子蟹時間較短、人工放流的規(guī)模較小、時間較短有關，短期內(nèi)的養(yǎng)殖活動和增殖放流活動對海州灣天然三疣梭子蟹群體的遺傳影響還十分有限，但這也提示我們進展連續(xù)多年跟蹤研究的必要性。

4 結論

目前海州灣三疣梭子蟹遺傳多樣性豐富，與養(yǎng)殖群體的遺傳組成存在差異，養(yǎng)殖活動和人工增殖放流對天然資源的遺傳影響還很有限，但要適時監(jiān)測二者的遺傳狀況，以防止天然基因庫受到養(yǎng)殖群體及人工增殖放流群體的干擾與污染;同時，建議增殖放流親本要選擇海州灣海捕的經(jīng)過遺傳評價的群體來進行繁殖放流，以避免對天然三疣梭子蟹遺傳資源造成影響。

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