高通量人乳頭瘤病毒分型檢測方法與序列分析和雜交捕獲法的性能比較研究

上海銘源數(shù)康生物芯片有限公司(上海,201403)港龍生物技術(shù)(深圳)有限公司( 深圳， 518057)

人乳頭瘤病毒(HPV)是一類感染人類上皮細(xì)胞DNA病毒，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了130多種HPV型，有40多種可感生殖腔[1]。HPV可以引起人全身各部位的皮膚或者粘膜感染，導(dǎo)致多種上皮組織疾病，例如皮膚尋常疣，扁平疣，外生殖器的尖銳濕疣等。宮頸上皮組織長期感染的某些型別的HPV可能引起基因突變，導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)增生(CIN)[2-3]和宮頸癌[4-5]。沒有HPV感染不可能導(dǎo)致宮頸癌，而有HPV感染不一定會導(dǎo)致疾病和宮頸癌。根據(jù)其導(dǎo)致宮頸癌風(fēng)險的高低將這些HPV分為高危型和低危型。高危型HPV可能引發(fā)婦女發(fā)生宮頸癌，主要包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、67、69、73、82等型別；低危型HPV主要引起尖銳濕疣，包括HPV6、11、40、42、43、44、54、55、57、61、71、81、83等型別。

以抗體捕獲、核酸雜交和化學(xué)發(fā)光信號放大技術(shù)為基礎(chǔ)的第二代雜交捕獲法(HCII，美國Qiagen公司產(chǎn)品)是最早獲得美國FDA批準(zhǔn)的臨床檢測HPV的方法[6]，能檢測13種高危型(包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68), 但是不具體分型。本研究采用的方法以PCR為基礎(chǔ)結(jié)合基因芯片(DNA微陣列)和反向點(diǎn)雜交技術(shù)對HPV進(jìn)行高通量分型檢測。基因芯片是生物芯片的一個種類，以陣列方式設(shè)定在平面基質(zhì)載體上形成能夠并行處理生物樣本中多個基因信息的微處理單元，它具有微型化和并行處理的特征，點(diǎn)陣排布點(diǎn)直徑在500 μm以內(nèi)，相鄰兩個點(diǎn)的中心點(diǎn)間距在1 000 μm以內(nèi)，點(diǎn)陣列用于檢測基因分子。利用微量點(diǎn)樣技術(shù)，將29種HPV型特異性探針點(diǎn)樣于基因芯片基質(zhì)上，制成基因芯片；經(jīng)過對樣本中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、雜交和顯色，檢測生殖道脫落細(xì)胞(如宮頸口、尿道口等部位脫落細(xì)胞)中的人乳頭瘤病毒(HPV)DNA，可分型檢測29種HPV型(包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、26、40、42、43、44、53、54、55、57、66、67、69、73、82)。適用于臨床HPV感染患者及可疑HPV感染人群輔助診斷。利用基因芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)大樣本平行進(jìn)行高通量分析。本研究通過宮頸細(xì)胞樣本的檢測，與HCII試劑的檢測結(jié)果進(jìn)行對比，對樣本感染HPV型別進(jìn)行序列分析驗(yàn)證，評價高通量人乳頭瘤病毒基因芯片的性能和臨床應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 檢測試劑 人乳頭瘤病毒分型檢測試劑盒(基因芯片法)由港龍生物技術(shù)深圳有限公司提供，HCII HPV檢測試劑購自Qiagen公司。

1.1.2 序列分析試劑 HotStar Taq Plus 購自Qiagen 公司，按照設(shè)計的型別特異性PCR引物擴(kuò)增特定型別PCR產(chǎn)物，委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行序列分析服務(wù)。

1.1.3 儀器 ABI 9700 型PCR儀(Life Technologies)，人乳頭瘤病毒基因分型檢測閱讀系統(tǒng)(港龍生物技術(shù)(深圳)有限公司)。

1.2 樣本處理和HPV檢測

宮頸脫落細(xì)胞樣本2 mL，均分為2份，其中一份樣本按照港龍生物技術(shù)(深圳)有限公司人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒(基因芯片法)的方法進(jìn)行處理。取出待處理標(biāo)本，振蕩混勻；置離心機(jī)中以13 000 rpm離心5 min；棄上清，保留沉淀物。DNA提取時，準(zhǔn)備2個離心管，分別加入陰性對照和陽性對照各5 μL。分別向上述對照品管及標(biāo)本管加入50 μL HPV DNA提取液，振蕩混勻；然后沸水浴(或干浴)10 min。將樣本管置離心機(jī)中，13 000 rpm離心10 min，保留上清液(DNA樣品)。 提取的DNA樣品3 μL直接加樣進(jìn)行PCR。另一份樣本按照HCII試劑的方法進(jìn)行處理和檢測。

1.3 HPV型特異性序列分析方法

在HPV 的L1區(qū)設(shè)計特異性引物(序列見表1)，用特異性引物對29種HPV型別對相應(yīng)型別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用型特異性的正向或反向引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析:對所有HPV分型檢測陽性樣本，包括HPV分型和HCII都為高危型陽性一致的樣本，用特異性引物擴(kuò)增，用其產(chǎn)物和特異性PCR引物測序；對于HCII陽性，而HPV分型結(jié)果為陰性的樣本，分別用29種型別的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，對產(chǎn)生的足夠PCR產(chǎn)物的樣本進(jìn)行序列分析。

特異性引物擴(kuò)增HPV DNA的反應(yīng)液20 μL體系的PCR反應(yīng)液組成為：1 PCR buffer Qiagen、0.4 mM 的dATP、dGTP、dCTP和dTTP(Takara)，正向引物和反向引物的濃度分別為2 pmol，0.1 μLHotStar Taq Plus (Qiagen), 樣本DNA加樣量為2 μL。特異性引物擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 5 min，94℃ 30 s、 56℃ 30 s、72℃ 30 s共45個循環(huán)，然后72℃ 延伸反應(yīng)5 min。HPV型特異性序列分析方法的靈敏度最低可以達(dá)到10拷貝/ L樣本。

表1 29種型別HPV L1區(qū)特異性擴(kuò)增引物序列Tab.1 The type-specific primers for PCR amplification of the segments in L1 gene among twenty-nine HPV genotypes

2 結(jié)果和討論

2.1 樣本的選擇

隨機(jī)選擇臨床門診生殖道HPV感染患者或可疑HPV感染病例，同時進(jìn)行高通量HPV分型檢測，并與HCII檢測結(jié)果進(jìn)行對比。本文試驗(yàn)包括來自三家醫(yī)院的500例樣本，其中包括156例HCII陽性和344例HCII陰性。將HCII陽性樣本設(shè)定為有病組，陰性樣本設(shè)定為無病組，假設(shè)本方法的靈敏度為95%、特異度為95%，在允許誤差δ為5%，顯著性水平α為0.05時，具有統(tǒng)計學(xué)意義的最小樣本量分別為：

N有病組= (1.96)2×(0.95)×(1HPV0.95)/(0.05)2=72.99 ≈ 73

N無病組= (1.96)2×(0.95)×(1HPV0.95)/(0.05)2=72.99 ≈ 73

有病組現(xiàn)有156例，無病組344例，大于上述計算要求，樣本數(shù)符合具有統(tǒng)計學(xué)意義的最小樣本量要求。

2.2 與HCII對比評價和分析

2.2.1與對比試劑的靈敏度和特異性評價

500例樣本比較高通量HPV分型檢測與HCII的檢測結(jié)果，其中高通量HPV分型檢測結(jié)果是指與HCII相同的13種高危型HPV檢測結(jié)果(即高危型HPV的陰陽性判斷)，評價陽性符合率、陰性符合率及總符合率(表2)。156例HCII陽性樣本中，高通量HPV分型檢測陽性143例、陰性13例；高通量HPV分型檢測的陽性符合率為91.7%；344例HCII陰性樣本中，高通量HPV分型檢測結(jié)果有陰性329例、陽性15例，高通量HPV分型檢測的陽性符合率為90.5% (95%置信區(qū)間: 85.9% ～95.1%)、96.2% (95%置信區(qū)間: 94.2% ～98.2%)和94.4%(95%置信區(qū)間: 92.4% ～96.4%)，Kappa值為0.870(95%置信區(qū)間: 0.782～ 0.958)，說明高通量HPV分型檢測與HCII一致性較好。

表2 高通量HPV分型檢測與HCII產(chǎn)品符合率評價Tab.2 Comparison between the high-throughput HPV genotyping assay (HPG) and HCII for the detection of High-risk HPV genotypes

* 與HCII試劑檢測范圍相同的13種高危型HPV檢測結(jié)果kappa=0.870(95%置信區(qū)間：0.782-0.958)

按照13種高危型HPV為標(biāo)準(zhǔn)判斷陰性和陽性，與HCII檢測不一致的樣本共有28例(表2)。 在陽性一致的樣本中，高通量HPV分型檢測方法可以得出型別結(jié)果和多型感染。對所有陽性樣本和多型感染樣本進(jìn)行序列分析，以DNA序列分析結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評價高通量HPV分型檢測方法的真實(shí)靈敏度和特異性，表3列出兩種方法不一致樣本的序列分析結(jié)果(HPV分型檢測至少有一種13種高危型的結(jié)果，與HCII結(jié)果一致，序列分析結(jié)果未列出)。

HCII與高通量HPV分型檢測結(jié)果不一致樣本中，包含HCII陽性而高通量HPV分型檢測陰性13例，經(jīng)DNA測序驗(yàn)證，其中有6例樣本含有低危型HPV感染、同時序列分析未檢出13種高危型；有1例樣本對13種高危型進(jìn)行型特異性PCR及測序分析為陰性，說明上述7例均為不含13種高危型HPV感染(HCII假陽性)，有3例樣本經(jīng)測序分析確認(rèn)分別為HPV16、HPV58和HPV68感染，說明HCII結(jié)果正確，高通量HPV分型檢測漏檢。另外，3例樣本DNA測序證實(shí)高通量HPV分型檢測分別未檢出HPV18、16、52高危型。以序列分析結(jié)果判斷，HCII陽性樣本中有6例含有13種高危型HPV(真陽性)，有7例不含13種高危型HPV(假陽性)，造成假陽性的樣本主要包含HPV66(3例)、HPV6(2例)和HPV53(1例)。

表3 HCII與高通量HPV分型檢測不一致樣本序列分析Tab.3 The sequences analysis of the discordant samples between HCII and HPG

注： 序列分析結(jié)果13種高危型HPV用黑體字表示

5例HCII陰性而高通量HPV分型檢測陽性樣本中，10例樣本經(jīng)DNA測序分析證實(shí)其中分別含有相對應(yīng)高危型存在，說明高通量HPV分型檢測結(jié)果正確，HCII漏檢(假陰性)；另有5例樣本高通量HPV分型檢測均檢出高危型，但測序未能確認(rèn)，判斷為高通量HPV分型檢測假陽性。以序列分析結(jié)果判斷，這15例HCII樣本有5例為真陰性，10例為假陰性。

序列分析結(jié)果與高通量HPV分型檢測方法和HCII對13種高危型HPV的檢測結(jié)果對比(表4)，以DNA測序分析結(jié)果判斷，500例樣本中，13種高危型陽性樣本共有159例、13種高危型陰性341例。以序列分析結(jié)果評價兩種方法的靈敏度和特異性(表5)，高通量HPV分型檢測的靈敏度和特異度分別達(dá)到96.2%(95%置信區(qū)間：93.3%～99.2%)和98.5%(95%置信區(qū)間：97.3%～99.8%)，HCII的靈敏度和特異度分別為93.7%(95%置信區(qū)間：89.9%～97.5%)和97.4%(95%置信區(qū)間：96.4%～99.5%)，說明高通量HPV分型檢測產(chǎn)品對13種高危型HPV DNA檢測的準(zhǔn)確性很高，高通量HPV分型檢測的靈敏度和特異度略高于HCII 。

表4 13種高危型的序列分析結(jié)果比較Tab.4 Comparison of the sequence analysis results with HPG and HCII

*與HCII試劑檢測范圍相同的13種高危型HPV檢測結(jié)果

表5 檢測的靈敏度和特異性比較Tab.5 Comparison of the sensitivity and specificity between HPG and HCII

注：括號內(nèi)數(shù)字表示95%置信區(qū)間

2.3 高通量HPV分型檢測分型準(zhǔn)確率評價

以DNA測序結(jié)果為評價標(biāo)準(zhǔn)，評價本產(chǎn)品分型準(zhǔn)確率。比較高通量HPV分型檢測檢測陽性樣本的測序結(jié)果，對測序確認(rèn)為多型感染的樣本，至少有2個型與高通量HPV分型檢測結(jié)果符合的判斷為分型準(zhǔn)確。如高通量HPV分型檢測多個型別，但是DNA測序驗(yàn)證僅證實(shí)其中某一型，則判斷為分型不準(zhǔn)確。如樣本DNA測序結(jié)果為陰性則不計入分型準(zhǔn)確率統(tǒng)計。

累計有197例樣本成功測序：其中分型準(zhǔn)確185例，包括138例單型感染和47例多重感染；分型不準(zhǔn)確樣本數(shù)為12例(表6)。以序列分析結(jié)果評價高通量HPV分析檢測方法的分型準(zhǔn)確率為93.9%(185/(197)。

表6 分型不準(zhǔn)確的樣本序列分析結(jié)果Tab.6 Comparison of the discordant samples between HPG and sequence analysis

注：(-)表示HPV陰性

2.4 HPV型別分布

根據(jù)DNA測序結(jié)果，29種HPV型在HPV陽性樣本中的分布(表7)。高通量HPV分型檢測優(yōu)異的分析性能，能夠檢測29種型別，靈敏度高，分型的準(zhǔn)確率高，為HPV的臨床分型檢測提供了可靠的方法，同時它還具有檢測通量高，檢驗(yàn)成本低，操作方法簡便等優(yōu)點(diǎn)，能夠極大的提高檢驗(yàn)工作效率，同時其對HPV的分型分析為疾病治療方案的選擇和HPV疫苗的研制都有很好的指導(dǎo)作用，適合臨床檢驗(yàn)工作的需要。

表7 29種型別在HPV陽性樣本中出現(xiàn)的頻率分布(高至低排列)Tab.7 The distribution of HPV genotypes in the study population with HPV-positive

5HPV18145.4%6HPV39114.2%7HPV6114.2%8HPV5493.5%9HPV3183.1%10HPV5183.1%11HPV4483.1%12HPV3372.7%13HPV6872.7%14HPV3562.3%15HPV4362.3%16HPV1151.9%17HPV5351.9%18HPV6651.9%19HPV4541.5%20HPV5541.5%21HPV5931.1%22HPV4231.1%23HPV6731.1%24HPV4020.8%25HPV2610.4%26HPV5710.4%27HPV6910.4%28HPV7310.4%29HPV8210.4%

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