魚(yú)類體表粘液凝集素研究進(jìn)展

黃智慧，馬愛(ài)軍，雷霽霖

1. 中國(guó)海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003

2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，青島市海水魚(yú)類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071

魚(yú)類皮膚上皮組織中分布有大量粘液細(xì)胞，所分泌粘液廣泛覆蓋在魚(yú)體表面構(gòu)成其與外界直接接觸的第一道門(mén)戶，在保護(hù)魚(yú)體免遭外界環(huán)境中的病菌、寄生物和病毒侵襲中至關(guān)重要（Huang et al,2009）。普遍認(rèn)為體表粘液中含有抵抗病原微生物入侵的非特異性免疫活性物質(zhì)，尤其自 1969年，F(xiàn)letcher & Grant（1969）提出在血清和粘液中均存在免疫球蛋白后，國(guó)、內(nèi)外研究者對(duì)魚(yú)類粘液的免疫功能產(chǎn)生了濃厚興趣。不斷有學(xué)者證實(shí)魚(yú)類體表分泌物中存在補(bǔ)體、溶菌酶、凝集素、C-反應(yīng)體、溶血素、抗菌肽及白細(xì)胞介素IL-1等多種生物活性因子（Alexander & Ingram, 1992; Buchman &Bresciani, 1998; Ingram, 1980）。凝集素作為具有糖專一性、可促進(jìn)細(xì)胞凝集的糖蛋白，為魚(yú)類體表粘液中的重要天然免疫因子，且已逐漸成為研究熱點(diǎn)。本文結(jié)合國(guó)內(nèi)、外研究成果，對(duì)魚(yú)類體表粘液凝集素的研究簡(jiǎn)史、分類、生物學(xué)性質(zhì)和功能進(jìn)行闡述。

1 魚(yú)類粘液凝集素研究簡(jiǎn)史

不同于免疫球蛋白，凝集素為不具酶催化活性的蛋白質(zhì)或糖蛋白，能專一、多價(jià)與糖非共價(jià)可逆結(jié)合，并具有凝集細(xì)胞和沉淀聚糖或糖復(fù)合物的作用（Sun, 1994; Zhang, 1999），廣泛存在于生物細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)，在脊椎動(dòng)物及無(wú)脊椎動(dòng)物的先天性免疫和宿主防御過(guò)程中起重要作用，參與異己識(shí)別、炎癥反應(yīng)、吞噬作用、細(xì)胞與細(xì)胞之間和細(xì)胞與外界之間的聯(lián)絡(luò)、受精、發(fā)育及再生等過(guò)程（Goldstein et al, 1980; Kilpatrick, 2002）。

凝集素最早由Stillmark在1888年從蓖麻籽和紅豆堿中發(fā)現(xiàn)，此后，1919年Sumner從豌豆中分離出結(jié)晶蛋白，命名為 ConA，并用此方法第一次獲得了純凝集素（Xiong et al, 2006）。20世紀(jì)70年代，凝集素獨(dú)特的性質(zhì)引起越來(lái)越多學(xué)者的興趣，并在很多生物體中被發(fā)現(xiàn)。Watkins & Morgan（1952）最早從鰻魚(yú)中提取得到糖特異性凝集素，后來(lái)研究確定為L(zhǎng)-fucose 凝集素。20世紀(jì)80年代后，在重組技術(shù)的支持下，魚(yú)類凝集素研究有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，人們從魚(yú)體中分離篩選出多種新的具有生物活性的凝集素。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類凝集素在體內(nèi)，如血清、體液、肌肉、血細(xì)胞及受精卵等（Jensen et al, 1997; Russel & Lumsden, 2005; Tateno et al, 2002; Yano, 1997），分布廣泛的同時(shí)，也分布于體外，如魚(yú)類體表粘液 （Suzuki et al, 2003）。

魚(yú)類皮膚是保護(hù)魚(yú)體與水環(huán)境接觸的一道物理和化學(xué)屏障。皮膚粘液除包圍入侵微生物外，還含有抗菌物質(zhì)。其中，凝集素可有效識(shí)別和結(jié)合異己物質(zhì)，產(chǎn)生凝集反應(yīng)，從而防止外來(lái)微生物等入侵魚(yú)體。Kamiya & Shimizu （1980）第一次從斑點(diǎn)犁齒鲆（Lophopsetta maculata）體表粘液中分離出了凝集素，隨后，Ingram（1980）提出了魚(yú)類體表含有凝集素，并將其描述為既非抗體類亦非酶類的碳水化合物結(jié)合蛋白。此后 30年，有關(guān)魚(yú)類體表粘液凝集素的研究有了更長(zhǎng)足的進(jìn)步，研究者們分別從阿拉伯海鲇（Arius thalassinus）、海鰻（Conger myriaster）、歐洲小龍（Repomucenus richardsoniii）、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）、岬羽鼬（Genypterus capensis）等多種魚(yú)體表粘液中分離并純化出了凝集素（Goto-Nance et al, 1995; Kamiya et al, 1988; Shiomi et al, 1989, 1990; Toda et al, 1996），不斷證實(shí)凝集素存在于魚(yú)類體表，并與體液免疫因子，如免疫球蛋白、補(bǔ)體、溶菌酶和血溶素等，具有同等重要的抵抗病原菌侵入的功能，在魚(yú)體天然免疫系統(tǒng)中至關(guān)重要。但當(dāng)時(shí)對(duì)體表粘液凝集素蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、分子結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能卻鮮有報(bào)道。Suzuki（1985）、Suzuki & Kaneko （1986）對(duì)日本鰻鱺（Anguilla japonica）凝集素紅血球凝集反應(yīng)的研究，提出的該凝集素存在于上皮組織杯形細(xì)胞中的推論，為體表粘液凝集素定位及其生物學(xué)功能研究的首次報(bào)道。其后，Muramoto & Kamiya（1992）對(duì)康吉鰻（Conger myriaster）粘液凝集素的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，并于1999年根據(jù)其蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)提出了康吉鰻體表粘液凝集素包括congerins Ⅰ和congerins Ⅱ兩種結(jié)構(gòu)類型。此后將近8年的時(shí)間里，東京大學(xué)又從日本鰻鱺、紅鰭東方鲀（Takifugu. Rubripes）及頸帶鲾（Leiognathus nuchalis）的體表粘液中分離出了不同的凝集素（Okamoto et al, 2005; Tasumi et al, 2004; Tsutsui et al, 2006），并分別進(jìn)行了結(jié)構(gòu)研究，最終根據(jù)其糖類識(shí)別位點(diǎn)（carbohydrate recognition domains,CRDs）的差異以及Ca2+依賴性將魚(yú)類體表粘液凝聚素確定為4種類型，此后在其他魚(yú)種中發(fā)現(xiàn)的粘液凝集素也大都?xì)w屬于以上 4類（Chen, 2010;Rajan et al, 2011）。

2 體表粘液凝集素結(jié)構(gòu)類型及其功能研究

迄今為止，共鑒定有 4種魚(yú)類體表粘液凝集素，即：半乳凝集素、C型凝集素、Lily型凝集素及L-鼠李糖結(jié)合凝集素（Suzuki et al, 2003），表現(xiàn)廣泛的分子多樣性。第1種類型屬于半乳凝素，其中包括從康吉鰻中分離出的 congerins Ⅰ，congerins Ⅱ，以及從日本鰻鱺中分離出的AJL-1，由于此類凝集素可特異性結(jié)合半乳糖或乳糖，故在皮膚粘液中占大多數(shù) （Suzuki, 1985; Suzuki &Kaneko, 1986）。第2種類型是典型的C型凝集素，最早發(fā)現(xiàn)于日本鰻鱺，命名為AJL-2（Tasumi et al,2002）。第3種類型是由紅鰭東方鲀中提取的特異性甘露糖凝集素，結(jié)構(gòu)與單子葉植物凝集素相似，被命名為L(zhǎng)ily-type lectin（Suzuki et al, 2003）。第4種提取自頸帶鲾（Leiognathus nuchalis），為特異性乳糖結(jié)合凝集素（PFL-1,PFL-2）（Okamoto et al,2005），由于其與從某些魚(yú)卵中所提取的 L-鼠李糖結(jié)合凝集素具有高度同源性，故被歸屬于L-鼠李糖結(jié)合凝集素家族 。另外，近期還發(fā)現(xiàn)了一種存在于魚(yú)類體表粘液中的特異內(nèi)源性凝集素（Tsutsui et al,2011），目前尚未確定該凝集素的分類，本文暫將其單列一類。

表1 體表粘液凝集素分類及特征匯總Table 1 Characteristics of skin mucus lectin in fish

2.1 半乳凝集素——galectins

Galectins又稱半乳凝集素，是廣泛存在的主要凝集素類型，具以下特性： Ca2+-不依賴性、特異的β-半乳糖苷酶活性、N-末端封閉、缺少單肽與糖基以及主要定位與細(xì)胞質(zhì) （Kilpatrick, 2000）。Galectin存在于動(dòng)物體內(nèi)及某些低等脊椎動(dòng)物的體表粘液中，如非洲爪蟾（Xenopus laevis）（Marschal et al, 1992）以及康吉鰻（congerins Ⅰ和 congerins Ⅱ）等（Suzuki, 1985; Suzuki ＆ Kaneko, 1986）。Tasumi et al（2002）對(duì)提取自日本鰻鱺的凝集素——AJL-1的結(jié)構(gòu)研究顯示，其表現(xiàn)β-半乳糖苷酶活性及 Ca2+-不依賴性，N-末端封閉，由 142個(gè)氨基酸殘基組成，無(wú)半胱氨酸，未非共價(jià)鍵結(jié)合的二聚體結(jié)構(gòu)，屬于galectin。而對(duì)其基因全長(zhǎng)的研究則顯示，AJL-1 426 bp的開(kāi)放閱讀框編碼142個(gè)氨基酸，同源性比較分析表明其與 congerins Ⅱ表現(xiàn)較高相似度（45%），且AJL-1具三個(gè)不同的糖結(jié)合殘基，與congerins Ⅰ結(jié)構(gòu)相似（Shirai et al, 1999）。這些證據(jù)都表明 AJL-1與康吉鰻粘液凝集素同源性較高?；虮磉_(dá)檢測(cè)顯示該凝集素僅存在于體表粘液，且表達(dá)含量很高（Kilpatrick, 2000）。AJL-1具有較強(qiáng)的抵抗病原微生物能力，對(duì)致病菌、鏈球菌屬均表現(xiàn)凝集活性，是魚(yú)類體表粘液中重要的防御因子。

2.2 獨(dú)特的C型凝集素

在動(dòng)物凝集素中，C型凝集素分布廣泛，功能復(fù)雜，涉及體內(nèi)許多重要的生理、病理過(guò)程。C型凝集素成員均含有一個(gè)或多個(gè)特征性糖類識(shí)別功能域（CRD），且該功能域能夠通過(guò)兩對(duì)或三對(duì)二硫鍵形成明顯而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，具有Ca2+-依賴性，其中有14個(gè)恒定殘基（包括4個(gè)C殘基）和18個(gè)保守殘基。大多數(shù) C型凝集素都與 D型甘露糖（D-mannose）、D 型葡糖糖（D-glucose）這一類的Man型配體（Gal-type ligands）或 D型半乳糖（D-galactose）及其衍生物結(jié)合（Kolatkar & Weis,1996）。目前研究最多甘露糖結(jié)合（mannose-binding protein, MBP）C型凝集素是激活免疫系統(tǒng)補(bǔ)體途徑的最主要因子（Dong et al, 2004; Wei et al, 2010;Zhang et al, 2010）。在魚(yú)類中，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）、大西洋鮭（Salmo salar）、日本牙鲆（Paralichthys olivaceus）以及大菱鲆（Scophthalmus maximus）中的C型凝集素均已被克隆并進(jìn)行了部分功能驗(yàn)證（Kondo et al, 2007;Nakao et al, 2006; Nikolakopoulou & Zarkadis, 2006;Richards et al, 2003; Zhang et al, 2010）。

上述C型凝集素均分布于體內(nèi)，直到2002年，Tasumi從日本鰻鱺體表粘液中分離出凝集素AJL-2，其結(jié)構(gòu)與C-type lectin相似，均具有一段保守性氨基酸序列，以及4個(gè)需要二硫鍵聯(lián)接的保守半胱氨酸殘基。AJL-2具有Ca2+-不依賴性，其基因序列中包括498 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼166個(gè)氨基酸，同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其與肋突螈（Pleurodeles），響尾蛇（Crotalus atrox）及小鼠等多個(gè)物種的C型凝集素同源，同源性≥30%。Northern blot分析發(fā)現(xiàn)，AJL-2僅存在于體表，且在魚(yú)體上皮組織中的杯型細(xì)胞分泌液泡中積累。凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，AJL-2的凝集模式與MBP結(jié)合方式相似，對(duì)病原菌E.coli K 12具有凝集作用，進(jìn)而抑制細(xì)菌穿透細(xì)胞膜進(jìn)入機(jī)體，或促使細(xì)菌陷入到體表粘液中最終被新分泌出來(lái)的粘液沖洗掉而起到保護(hù)魚(yú)體的作用（Tasumi et al, 2002）。

Tsutsui et al （2007）由康吉鰻體表粘液中發(fā)現(xiàn)了另一種對(duì)酵母菌具凝集活性的甘露糖特異性結(jié)合凝集素，并稱之為 conCL-s，與之前在康吉鰻中發(fā)現(xiàn)的 congerins Ⅰ和 congerins Ⅱ不屬于同一類型。該凝集素為四聚體結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)以二硫鍵結(jié)合且單體分子量為16×103的二聚體組成，其結(jié)構(gòu)屬于C-type lectin家族。conCL-s對(duì)酵母菌的結(jié)合表現(xiàn)明顯Ca2+-不依賴性?；虮磉_(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于機(jī)體內(nèi)部和外部粘膜組織中，如皮膚、鰓、舌和食道，在這些組織中，conCL-s對(duì)細(xì)菌具有凝集性，且在康吉鰻巨噬細(xì)胞中，lectin結(jié)合微球體可顯著提高細(xì)胞的吞噬作用。這些發(fā)現(xiàn)均表明conCL-s具有調(diào)理素的作用，在體表天然免疫系統(tǒng)中起重要作用。

2.3 Lily型凝集素——pufflectin

Suzuki et al（2003）將從紅鰭東方鲀體表粘液中提取出的pufflectin認(rèn)定為第3種類型凝集素，并命名為“Lily-type lectin”。該凝集素較為特殊，cDNA全長(zhǎng)527 bp，包括編碼116個(gè)氨基酸的348 bp開(kāi)放閱讀框，其上游區(qū)無(wú) ATG翻譯起始位點(diǎn)，即不含單肽的特征常見(jiàn)于半乳凝集素（Kilpatrick, 2000）。Pufflectin氨基酸序列與目前發(fā)現(xiàn)的任何一類動(dòng)物凝集素均無(wú)同源性，卻與單子葉植物的甘露糖凝集素高度同源，如雪花蓮（Galanthus nicalis）、水仙花（Narcissus hybrid cultivar）、韭菜（Allium prorrum）和大蒜（A.sativum）等。這些植物的凝集素都含有三個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)，而pufflectin被證實(shí)含有其中兩個(gè)（Tsutsui et al, 2007）。這類凝集素在體內(nèi)分布廣泛，在鰓、口腔壁、食道以及體表都有表達(dá)。據(jù)報(bào)道，凝集素與細(xì)菌具有特異性凝集現(xiàn)象，而pufflectin與細(xì)菌并不發(fā)生凝集反應(yīng)，但卻對(duì)寄生蟲(chóng)具有凝集活性，這一發(fā)現(xiàn)指出其對(duì)魚(yú)體在由寄生蟲(chóng)引起的機(jī)體防御系統(tǒng)中起重要作用。Pufflectin是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與寄生蟲(chóng)有凝集現(xiàn)象的魚(yú)類體表粘液凝集素，證實(shí)了凝集素對(duì)細(xì)菌及寄生蟲(chóng)均具天然免疫功能。

2.4 L-鼠李糖結(jié)合凝集素——PFL-1，PFL-2

第四種類型粘液凝集素為提取自頸帶鲾（ponyfish Leiognathus nuchalis）的特異性乳糖結(jié)合凝集素（PFL-1,PFL-2），cDNA全長(zhǎng)1 086 bp,包括693 bp開(kāi)放閱讀框，編碼231個(gè)氨基酸。PFL-1與從某些魚(yú)卵中提取的 L-鼠李糖結(jié)合凝集素高度同源，均擁有一段保守的串聯(lián)重復(fù)序列，故歸屬于L-鼠李糖結(jié)合凝集素家族。但PFL-1僅表達(dá)于體表粘液，而不存在于性腺、鰓、肝臟、脾臟以及腸道。PFL-2與PFL-1 的N-末端氨基酸序列高度相似，被確認(rèn)與PFL-1同型（Okamoto et al, 2005）。該種凝集素亦具有凝集細(xì)菌，阻止其進(jìn)入而保護(hù)魚(yú)體的重要免疫功能，但其具體作用機(jī)理尚無(wú)報(bào)道。

2.5 新發(fā)現(xiàn)的粘液凝集素

Tsutsui et al（2011）在鯰魚(yú)（Silurus asotus）體表粘液中發(fā)現(xiàn)了具甘露糖結(jié)合的 Ca2+-依賴活性的甘露糖結(jié)合凝集素。凝膠過(guò)濾結(jié)果顯示，其具有單聚體和二聚體形式，為由308個(gè)氨基酸組成的分泌蛋白，與哺乳動(dòng)物和魚(yú)類內(nèi)源凝集素同源。該凝集素基因在魚(yú)類的鰓部、腎和皮膚都有所表達(dá)?？寡宸磻?yīng)監(jiān)測(cè)顯示，內(nèi)源性凝集素蛋白存在于皮膚和鰓的杯型細(xì)胞、腎臟及血漿。此凝集素對(duì)病原微生物具有凝集活性，揭示其在魚(yú)類體表抵抗外來(lái)細(xì)菌侵入的自我保護(hù)系統(tǒng)中至關(guān)重要。而且，該凝集素的發(fā)現(xiàn)證實(shí)內(nèi)源性蛋白同樣存在于魚(yú)類體表粘液，為對(duì)凝集素家族功能的補(bǔ)充。目前該凝集素分類尚未確定，暫將其歸為內(nèi)源性凝集素類。隨著分子生物學(xué)、蛋白組學(xué)技術(shù)及測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)、蛋白組圖譜等高端技術(shù)，研究者在其他魚(yú)種中發(fā)現(xiàn)了粘液凝集素，如Rajan et al （2011）在對(duì)大西洋鱈魚(yú)（Gadus morhua）粘液進(jìn)行比較蛋白組學(xué)研究時(shí)，就發(fā)現(xiàn)其存在Galectin-1及甘露糖凝集素（MBL），Bo et al（2012）構(gòu)建感染鰻弧菌青鳉魚(yú)（Oryzia melastigma）的消減文庫(kù)，Blast比對(duì)獲得了其粘液凝集素。但目前尚未深入開(kāi)展這些凝集素分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及凝集反應(yīng)現(xiàn)象等有關(guān)功能特性的研究。

3 魚(yú)類體表粘液凝集素功能性研究展望

凝集素功能性研究開(kāi)展較早的是植物凝集素，對(duì)其生理功能以及分子機(jī)制等都有較深入探究，尤其是為防治病蟲(chóng)害開(kāi)拓了新思路。植物凝集素被認(rèn)為是植物防御系統(tǒng)的重要組成部分，目前，更多應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)品種的培育及抗病品種的篩選。海洋生物凝集素相對(duì)發(fā)展較晚，自 20世紀(jì)70年代后期，其在貝類免疫識(shí)別中的作用才為人們所關(guān)注，隨著研究的深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)海洋生物凝集素的生物活性絕不遜色于陸生植物凝集素，且水產(chǎn)動(dòng)物凝集素的研究也已有不少報(bào)道（James &Rowland, 1974；Muramoto et al, 1994）。其中，魚(yú)類凝集素通過(guò)有效識(shí)別和結(jié)合異己物質(zhì)，提高吞噬細(xì)胞對(duì)異己物質(zhì)的吞噬、滅殺作用，以及作為免疫活性物質(zhì)保護(hù)機(jī)體的防御功能已得到了越來(lái)越多的關(guān)注。

魚(yú)類體表粘液及其中所包含的凝集素，以及凝集素的分子結(jié)構(gòu)多樣性在保護(hù)魚(yú)體免遭外界環(huán)境中的病菌、寄生物和病毒的侵襲中至關(guān)重要（Huang et al,2009）。粘液凝集素對(duì)寄生蟲(chóng)也表現(xiàn)強(qiáng)烈的凝集活性，同時(shí)，還具有調(diào)理素的功能。因此，掌握其生物功能的多樣性及特殊性，對(duì)于了解魚(yú)類粘液免疫系統(tǒng)以及抵抗外界環(huán)境脅迫效應(yīng)都有著廣泛的應(yīng)用前景。

日本東京大學(xué)SuzukiYuzuru教授經(jīng)過(guò)近10年的研究，目前，已從多個(gè)物種中分離純化出了凝集素，并對(duì)其蛋白及分子結(jié)構(gòu)作了詳細(xì)分析和功能驗(yàn)證，根據(jù)其對(duì)糖特異性結(jié)合位點(diǎn)及對(duì)Ca2+-依賴性等結(jié)構(gòu)性特性進(jìn)行了初步分類。但這些成果對(duì)于大規(guī)模凝集素功能性應(yīng)用開(kāi)發(fā)而言，只是初級(jí)階段，關(guān)于體表粘液凝集素的功能性分子機(jī)理以及應(yīng)用性研究仍需進(jìn)一步研究。筆者認(rèn)為，凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合，而不影響其生物活性，可用于光鏡或電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)研究工作，探究機(jī)體在處于環(huán)境脅迫條件下的體表上皮細(xì)胞分化、增生和惡變的生物學(xué)演變過(guò)程，了解病理變化，從而對(duì)機(jī)體狀態(tài)作出診斷評(píng)價(jià)。而且粘液凝集素對(duì)于不同類型的細(xì)菌具有特異凝集活性，可以作為粗略鑒定病原微生物的指示因子。

總之，粘液凝集素作為生物體內(nèi)特殊的糖蛋白，存在于魚(yú)體與外界直接接觸的第一道門(mén)戶——體表粘液中，在魚(yú)類整個(gè)生命過(guò)程中至關(guān)重要。它在認(rèn)識(shí)和解決魚(yú)類集約化、半集約化養(yǎng)殖疾病防治中的重要意義也得到了越來(lái)越多的關(guān)注，而且隨著生物工程研究手段和研究領(lǐng)域的不斷擴(kuò)大，對(duì)其開(kāi)發(fā)、利用和生化工程技術(shù)的拓展將具有廣闊應(yīng)用前景。