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    HtrA2在大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)

    2013-12-17 05:44:06魏志玄
    關(guān)鍵詞:胞漿膠質(zhì)瘤線粒體

    宋 宇 魏志玄

    南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 南陽(yáng) 473000

    目前,圍繞膠質(zhì)瘤病因和發(fā)病機(jī)制的研究非常普遍。其中,細(xì)胞凋亡在膠質(zhì)瘤發(fā)病中的作用越來(lái)越受重視。HtrA蛋白家族是一類寡聚絲氨酸蛋白酶,作為其成員之一的HtrA2在某些病理或應(yīng)激狀態(tài)下釋放至胞漿可以激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。HtrA2作為一種前凋亡因子的作用已經(jīng)在很多研究中得到確認(rèn),其活性降低可能導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的發(fā)展。本文采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤中HtrA2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),為進(jìn)一步研究其在膠質(zhì)瘤發(fā)展中的作用打下基礎(chǔ)。

    1 資料與方法

    1.1 標(biāo)本與資料 大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;SD 大鼠購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,所用一抗為兔抗Omi/HtrA2多克隆抗體(英國(guó)Abcam 公司),封閉劑、二抗、DAB 顯色試劑盒(英國(guó)Novolink公司),胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)sigma公司;計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(Leica QWin Image Processing and Analysis System.英國(guó)Leica Imaging System Ltd公司)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法 (1)采用C6細(xì)胞立體定向移植的方法構(gòu)建大鼠膠質(zhì)瘤模型,成功后取腫瘤組織標(biāo)本;(2)采用非生物素檢測(cè)系統(tǒng):4mm 石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后,檸檬酸緩沖液微波法修復(fù)抗原;(3)加3%雙氧水20min,以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性;5%兔封閉血清室溫下封閉20 min;加Omi/HtrA2抗體(1∶400),4℃過(guò)夜;加第2抗體室溫下孵育20min;加鏈抗親和素室溫下孵育20min;DAB染色,顯微鏡下觀察,滿意后終止,封片。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。使用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)Omi/HtrA2的免疫組化染色的強(qiáng)度和范圍進(jìn)行定量分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)雙側(cè)α=0.05。

    2 結(jié)果

    HtrA2蛋白在正常大鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞和大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞化學(xué)染色均有陽(yáng)性表達(dá)(圖AB),DAB棕黃色顆粒著色在胞漿中,實(shí)驗(yàn)組20 例,18 例陽(yáng)性表達(dá);正常對(duì)照組20 例,1例陽(yáng)性表達(dá),在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)高于正常腦膠質(zhì)細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    圖A:正常細(xì)胞;圖B:膠質(zhì)瘤細(xì)胞

    3 討論

    生理?xiàng)l件下HtrA2是作為線粒體中的分子伴侶而發(fā)揮作用,從而促進(jìn)細(xì)胞存活而非凋亡。但在接受某些病理因素或外源性刺激的狀態(tài)下(如缺血再灌注、某些化療藥物作用、抗Fas抗體或暴露于紫外線的照射),HtrA2可轉(zhuǎn)變?yōu)榍暗蛲鲆蜃佣l(fā)揮促細(xì)胞凋亡的作用。成熟HtrA2蛋白的N 端包含一個(gè)四肽基序,可與各種凋亡抑制蛋白(IAPs)發(fā)生相互作用。當(dāng)接受到凋亡刺激后,HtrA2 從線粒體釋放至胞漿中,并 降 解 各 種IAPs,如XIAP、cIAP1、cIAP2 和Apollon/BRUCE。由于IAPs被分解導(dǎo)致caspase3、7、9激活,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1]。用十字孢堿處理HeLa細(xì)胞,觀察到HtrA2釋放到胞漿中并與一種絲氨酸-蘇氨酸激酶WARTS(一種潛在的腫瘤抑制蛋白)結(jié)合成復(fù)合物。HtrA2-WARTS與XIAP發(fā)生作用并將其水解。表達(dá)WARTS的HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出更易受十字孢堿或紫外線的作用而發(fā)生細(xì)胞凋亡,當(dāng)其表達(dá)成熟的HtrA2時(shí),這種凋亡現(xiàn)象更顯著[2]。Gupta等研究HtrA2與神經(jīng)退行性疾病關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn),在淀粉樣蛋白b積蓄導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過(guò)程中有HtrA2的參與。淀粉樣蛋白b的積蓄可導(dǎo)致HtrA2釋放至細(xì)胞質(zhì)并與早老素1發(fā)生交互作用,其 結(jié) 果 是 使HtrA2 對(duì)XIAP、cIAP1 和cIAP2 的 水 解 活性增強(qiáng),從而引發(fā)神經(jīng)元產(chǎn)生caspase依賴性的細(xì)胞凋亡過(guò)程。

    HtrA2除可以分解凋亡抑制蛋白IAP之外,還能分解其他一些表現(xiàn)出抗凋亡活性的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞接受紫外線照射的條件下,HtrA2與胞漿中的ped/pea15蛋白結(jié)合并將其分解。Ped/pea15發(fā)揮抗凋亡作用主要是依賴于其能在多個(gè)水平上抑制caspase途徑的激活。HtrA2分解ped/pea15促進(jìn)了紫外線介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[3]。HtrA2同樣裂解抗凋亡蛋白Hax-1,后者是Bcl-2蛋白家族的成員,對(duì)線粒體膜電位起著調(diào)控作用,這個(gè)裂解過(guò)程發(fā)生于凋亡極早期的線粒體中[4]。此 外 還 有 證 據(jù) 表 明,Hax-1 對(duì)caspase9 有 抑 制 作用[5]。除了降解抗凋亡蛋白之外,HtrA2也可分裂前凋亡蛋白p73從而增強(qiáng)其作用。接受凋亡刺激后,HtrA2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中并分解p73,經(jīng)過(guò)水解修飾的p73增強(qiáng)了bax基因的表達(dá),而bax的表達(dá)產(chǎn)物可以刺激細(xì)胞凋之[6]。最近研究表明,HtrA2參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。衣霉素是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)物,用衣霉素處理細(xì)胞可以使線粒體中的HtrA2水平逐漸升高并釋放出線粒體外,顯著增加細(xì)胞凋亡比例。這些結(jié)果表明,由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡,HtrA2是在其中起作用的[7]。HtrA2也能通過(guò)caspase非依賴性的途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,因?yàn)镠trA2 的IAP結(jié)合基序的突變可以阻止其與IAPs的結(jié)合,但不能完全廢除其促細(xì)胞凋亡的特性,這一現(xiàn)象的具體機(jī)制目前尚不清楚。

    HtrA2在細(xì)胞的失巢凋亡中也發(fā)揮著作用。對(duì)失巢凋亡的抵抗是癌癥細(xì)胞的共同特性,這有助于癌癥的轉(zhuǎn)移。正常細(xì)胞脫離細(xì)胞基質(zhì)之后,某些成分的表達(dá)或活性發(fā)生改變,激活凋亡通路。這其中包括抗凋亡蛋白Bcl-XL 表達(dá)下調(diào),從而引發(fā)各種前凋亡因子從線粒體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中,這其中就包括了HtrA2?,F(xiàn)已明確癌基因ras通過(guò)阻止HtrA2釋放出線粒體外從而抑制失巢腸上皮細(xì)胞的凋亡。在這個(gè)模型中,外源性表達(dá)HtrA2 可以增加失巢細(xì)胞的凋亡傾向[8]。目前有證據(jù)表明,HtrA2參與腫瘤發(fā)生。HtrA2廣泛表達(dá)于各種腫瘤細(xì)胞系,并且其表達(dá)程度具有細(xì)胞特異性。已發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)成熟HtrA2可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)活檢標(biāo)本的分析表明,HtrA2的表達(dá)水平在腫瘤組織和正常組織中存在差異。HtrA2蛋白水平在子宮內(nèi)膜癌組織中顯著降低[9],在卵巢腫瘤中也有下降,尤其是良惡交界性卵巢腫瘤[10]。與此相反,HtrA2 在前列腺癌組織中過(guò)表達(dá)而在正常前列腺或前列腺良性增生組織中低表達(dá)或不表達(dá)。這個(gè)現(xiàn)象可能與前列腺癌細(xì)胞分化有關(guān)[11]。HtrA2同樣在高級(jí)別胃腺癌中高表達(dá),在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期雌激素處理金黃地鼠腎細(xì)胞誘發(fā)的腫瘤中,HtrA2 同樣高表達(dá)[12]。HtrA2 在癌癥起源中的地位尚未完全研究清楚。然而,鑒于HtrA2在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,那么它與腫瘤發(fā)展之間的關(guān)系是顯而易見(jiàn)的,因?yàn)槟[瘤細(xì)胞之所以增殖是因?yàn)槠湟种屏四軌蛞l(fā)細(xì)胞凋亡的各種機(jī)制。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HtrA2在膠質(zhì)瘤中表達(dá)異常,其與腫瘤發(fā)展之間的關(guān)系需要進(jìn)一步探討。

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