微波輔助提取瑞香狼毒總黃酮工藝條件的優(yōu)化*

龔 磊，黃小容，龔其海，許 潔，頡江敏 ，李玲如

1)遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科遵義563003 2)遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室遵義563003 3)遵義醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室遵義563003 4)遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 遵義563003 5)遵義醫(yī)學(xué)院藥物制劑2008 屆畢業(yè)生 遵義563003

#通訊作者，男，1944年5月生，教授，研究方向:藥物化學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail:jiejiangmin@vip.sohu.com

瑞香狼毒(stellera chamaejasme L.)為瑞香科狼毒屬植物，又名紅狼毒、棉大戟、斷腸草等，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌和抗結(jié)核的作用等。瑞香狼毒總黃酮是從瑞香狼毒中提取的一種重要組分，具有抗腫瘤作用［］。近年來，微波技術(shù)在天然植物的有效成分提取中得到了廣泛應(yīng)用，具有設(shè)備簡單、節(jié)省時(shí)間、投資少、適用范圍廣、提取效率高、重現(xiàn)性好、節(jié)省試劑且污染小等優(yōu)點(diǎn)［2-3］。作者應(yīng)用微波輔助提取瑞香狼毒總黃酮，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法分別對料液比、溶劑濃度、微波功率及提取時(shí)間4 個(gè)因素進(jìn)行考察，以期得到微波輔助提取最佳工藝條件，為進(jìn)一步深入開發(fā)和利用瑞香狼毒提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 藥材、試劑及儀器 瑞香狼毒由蘭州市藥材供應(yīng)站提供，經(jīng)河南省南陽市藥監(jiān)所黃海歐副教授鑒定為瑞香科植物瑞香狼毒(stellera chamaejasme L.);槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品為上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品;體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、甲醇等均為分析純。JA1003N 型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，XH-100A 電腦微波催化合成/萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)，UV-2550 型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.2 瑞香狼毒總黃酮微波輔助提取方法的建立

1.2.1 瑞香狼毒樣品液的制備 稱取5.000 g 瑞香狼毒原料，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)95%乙醇微波輔助提取后，揮發(fā)溶劑得浸膏，經(jīng)甲醇溶解，定容到50 mL 容量瓶中，取0.2 mL 溶液稀釋到25 mL，取2 mL 稀釋液加甲醇定容到10 mL 即得瑞香狼毒樣品液。原料在微波輻射前均需用相應(yīng)提取溶劑預(yù)浸泡2 h，使溶劑充分浸透原料，利于吸收微波輻射。

1.2.2 總黃酮含量的測定 以槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品為對照品，采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測定。精密稱取110℃干燥恒重的對照品2.002 mg，用甲醇定容于50 mL 容量瓶中，取0.2 mL 溶液到25 mL 容量瓶，加甲醇稀釋，定容，得質(zhì)量濃度為0.32 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置于10 mL 容量瓶，定容，依次在298 nm 波長處測定吸光度。以吸光度(A)對質(zhì)量濃度(C)作直線回歸，回歸方程為A=0.098 56 C+0.090 04(r=0.999 6)，以此方程測算樣品液總黃酮含量。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)選

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)條件 選擇對瑞香狼毒總黃酮得率有影響的4 個(gè)因素，即料液比(A)、乙醇濃度(B)、微波功率(C)和提取時(shí)間(D)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。①設(shè)定乙醇濃度(體積分?jǐn)?shù)90%)、微波功率(800 W)、提取時(shí)間(60 s)，選擇5 種料液體積比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)。②設(shè)定料液比(1:20)、微波功率(800 W)、提取時(shí)間(60 s)，分別選擇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%和90%的乙醇作為溶劑。③設(shè)定乙醇濃度(體積分?jǐn)?shù)90%)、料液比(1:20)、提取時(shí)間(60 s)，選擇5 種不同微波功率(500、600、700、800 和900 W)。④設(shè)定乙醇濃度(體積分?jǐn)?shù)90%)、料液比(1:20)、微波功率(800 W)，選擇5 種提取時(shí)間(30、60、90、120 和150 s)。在上述條件下按1.2 法進(jìn)行瑞香狼毒總黃酮的提取，計(jì)算總黃酮得率。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇上述4 個(gè)因素的較優(yōu)水平，按L9(34)設(shè)計(jì)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對總黃酮得率的影響 在選定其他3 個(gè)因素水平的條件下，以不同料液比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，總黃酮得率見表1。

表1 不同料液比條件下總黃酮得率(n=3)

2.1.2 乙醇濃度對總黃酮得率的影響 在選定其他3 個(gè)因素水平的條件下，以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為溶劑，總黃酮得率見表2。

表2 不同乙醇濃度條件下總黃酮的得率(n=3)

2.1.3 微波功率對總黃酮得率的影響 在選定其他3 個(gè)因素水平的條件下，以不同微波功率進(jìn)行提取，總黃酮得率見表3。

2.1.4 提取時(shí)間對總黃酮得率的影響 在選定其他3 個(gè)因素水平的條件下，以不同提取時(shí)間進(jìn)行提取，總黃酮得率見表4。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表5，結(jié)果見表6和7?？梢钥闯觯瑢θ鹣憷嵌究傸S酮得率的影響大小依次為:乙醇濃度(B)＞微波功率(C)＞料液比(A)＞提取時(shí)間(D)。微波萃取的優(yōu)化工藝條件是B3C3A2D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，提取時(shí)間60 s，料液比1:25，微波功率900 W。按此工藝條件下進(jìn)行了3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總黃酮得率分別為33.232，33.157 和33.163 mg/g，平均33.184 mg/g。

表3 不同微波功率條件下總黃酮得率(n=3)

表4 不同提取時(shí)間條件下總黃酮得率(n=3)

表5 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)的因素水平

表6 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

3 討論

微波輔助提取技術(shù)較傳統(tǒng)提取技術(shù)具有提取效率高的明顯優(yōu)點(diǎn)［4］。在瑞香狼毒中，黃酮類成分含量較高，黃酮類化合物熱穩(wěn)定性較好，極性較大，適宜于微波輔助萃取技術(shù)。

該研究以總黃酮得率為考察指標(biāo)，探討了溶劑乙醇濃度、料液比、微波功率和提取時(shí)間對瑞香狼毒總黃酮提取結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，上述4 個(gè)因素對總黃酮得率均有很大影響。因?yàn)槿軇O性隨乙醇濃度的增大而減小，極性大的溶劑吸收了大部分微波能，而藥材沒有足夠的微波能吸收，所以隨著溶劑極性的增加，總黃酮的得率反而減小。當(dāng)料液比小于1:25時(shí)，隨著料液比的增大，總黃酮得率不斷增大，其原因是:提取液體積越大，溶劑與浸提物的接觸越充分，在相同時(shí)間內(nèi)能溶解出更多的黃酮類化合物，使得率增大［5］。當(dāng)料液比大于1:25 時(shí)，得率變化并不顯著，說明黃酮類化合物溶解基本飽和。當(dāng)微波功率設(shè)定在500～800 W時(shí)，隨著功率的增大，得率增大，原因主要是:天然黃酮的萃取溫度由黃酮的熱敏性決定，微波功率和萃取溫度成正相關(guān)，在萃取時(shí)間固定時(shí)，萃取溫度隨著微波功率的增大而升高，細(xì)胞壁裂解率增高，細(xì)胞內(nèi)吸收微波能的極性分子易溶出。在800～900 W 時(shí)，隨著微波功率的增大，總黃酮得率逐漸下降，這是因?yàn)闇囟冗^高引起蛋白等不耐熱的成分糊化，造成黃酮類成分的黏附，從而導(dǎo)致得率降低。作者還觀察到，得率隨提取時(shí)間的延長而明顯增大，當(dāng)提取時(shí)間大于60 s 時(shí)，得率明顯下降。

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，作者采用正交實(shí)驗(yàn)確定了微波輔助提取瑞香狼毒總黃酮的最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳工藝條件為料液比1:25，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，微波功率900 W，提取時(shí)間60 s。在此條件下總黃酮平均得率為33.184 mg/g，該方法簡單、易行，且快速、節(jié)能，值得推廣應(yīng)用。

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