杜氏鹽藻鞭毛內(nèi)運輸?shù)鞍?8在鞭毛組裝過程中的功能分析及其原核表達(dá)*

韓 康，石 科，毛麗紅，李慶華，龔方華，蔣海麗，薛樂勛1，

1)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州450052#通訊作者，男，1944年2月生，本科，教授，研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

鞭/纖毛內(nèi)運輸(intraflagellar transport，IFT)是存在于纖毛內(nèi)部的一種運輸機(jī)制，很多纖毛相關(guān)蛋白在纖毛內(nèi)是借助這種機(jī)制而實現(xiàn)定向運動，這種運輸主要依靠IFT 復(fù)合體，這些復(fù)合體能夠通過馬達(dá)蛋白和軸絲相連，并負(fù)責(zé)纖毛內(nèi)部的多種成分的結(jié)合，從而達(dá)到運輸?shù)哪康模?］。IFT 復(fù)合體包含20種以上IFT 蛋白，分別為IFT-A 和IFT-B。IFT 是一種雙向運輸機(jī)制，包括基部到頂端的正向運輸和頂端到基部的逆向運輸，其中，IFT-B 主要負(fù)責(zé)正向運輸，而IFT-A 與貨物的逆向運輸相關(guān)［2］，正是這種可控的雙向運輸機(jī)制，調(diào)控著纖毛有序的組裝、維持和解聚過程。IFT88 是IFT-B 的成分之一，它是由IFT88 基因所編碼的，這種基因能編碼三四氨基酸重復(fù)序列(tetratricopeptide repeat，TPR)家族，此重復(fù)序列能介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間相互作用［3］，對于IFT88 蛋白的運輸功能起著極其重要的作用。在衣藻細(xì)胞內(nèi)能夠與IFT52、IFT46、HSP40 相互作用;在小鼠中，IFT88 同源蛋白Tg737 的突變會引起多囊腎疾?。?］，且Tg737 的突變與小鼠的視覺、嗅覺的功能障礙也有一定關(guān)系［5-6］。杜氏鹽藻是一種高度耐鹽的單細(xì)胞且具有雙鞭毛的真核生物，有一對約13 μm的等長鞭毛，生長周期短，培養(yǎng)方式簡單，可作為研究鞭毛的模式生物。作者利用鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鹽藻轉(zhuǎn)錄組的已知片段，利用3'RACE 及5'擴(kuò)增得到IFT88 基因序列，采用實時熒光定量PCR 方法觀察IFT88 mRNA 在杜氏鹽藻鞭毛再生過程中的表達(dá)情況。預(yù)測并擴(kuò)增其開放閱讀框后，成功構(gòu)建其原核表達(dá)載體，為進(jìn)一步的功能分析提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 杜氏鹽藻UTEX LB-1644 購自美國德克薩斯州大學(xué)，大腸桿菌DH5α 為鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室保存菌種，載體pMD19-T、EcoR I、Hind Ⅲ等DNA 限制性內(nèi)切酶及IPTG 均購自大連寶生物工程有限公司;PCR 特異性引物由北京華大基因生物技術(shù)有限公司合成;膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 小量制備試劑盒購自Axygen 公司，Real Master Mix(SYBR Green)購自天根生化科技(北京)有限公司;HPG400 型光照培養(yǎng)箱購自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，紫外分光光度計為Thermo 公司產(chǎn)品，7300 實時熒光定量PCR 儀購自System Applied Biosystems 公司。

1.2 杜氏鹽藻IFT88 cDNA 3' 端序列擴(kuò)增及拼接根據(jù)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室轉(zhuǎn)錄組測序片段，用Primer Premier 5.0 設(shè)計2 個3'RACE上游引物:5'-TTGCGGTTGCTGGAGGTG-3'(18 bp)、5'-CAAGCGTCAGAATTACATCA-3'(20 bp)。下游引物為3'RACE 試劑盒中自帶引物:3'RACE 內(nèi)側(cè)引物5'-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'(32 bp)和3'RACE 外側(cè)引物5'-TACCGTCGTTC CACTAGTGATTT-3'(23 bp)。提取對數(shù)生長期杜氏鹽藻的總RNA，按照First Choice RLM-RACE Kit 說明進(jìn)行操作。PCR 反應(yīng)體系:cDNA 1 μL，上、下游引物(50 μmol/L)各1 μL，dNTP(10 mmol/L)8 μL，10×LA Buffer 10 μL，dH20 補(bǔ)至100 μL。巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，與pMD19-T 連接，過夜并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，用含有氨芐青霉素抗性、IPTG 和X-Gal 的平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后經(jīng)雙酶切鑒定，隨后將菌液送公司測序，將測序結(jié)果與原序列進(jìn)行拼接。

1.3 杜氏鹽藻IFT88 cDNA 5' 端序列擴(kuò)增及拼接根據(jù)拼接的3'端序列，設(shè)計5'端下游引物序列，外側(cè)引物5'-ATGCCAGCCCAATGTTCC-3'(18 bp)，內(nèi)側(cè)引物5'-GTTTCGCACGAGGTCTGT-3'(18 bp)。上游引物消減雜交文庫特有引物:5'-AAGCAGTGG TATCAACGCAGAGTACXXXXX-3'(X = SMARTer 機(jī)密的寡核苷酸序列)(30 bp)，巢式PCR 擴(kuò)增IFT88 cDNA 的5'端序列，PCR 產(chǎn)物用10 g/L 瓊脂糖凝膠檢測，回收后與pMD19-T 載體連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。提質(zhì)粒，EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定，送公司測序后，將測序結(jié)果與已知序列進(jìn)行拼接。

1.4 實時熒光定量PCR 使用機(jī)械研磨法去除杜氏鹽藻鞭毛［7］，在去除鞭毛后的180 min 內(nèi)每30 min 取樣1 次，用Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 作為模版，設(shè)計一對引物5'-ACAGACCTCGT GCGAAAC-3' (18 bp)、5'-ATGCCAGCCCAATGT TCC-3'(18 bp)，以GAPDH 作為內(nèi)參，進(jìn)行實時熒光定量PCR，隨后導(dǎo)出數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5 驗證開放閱讀框及其原核表達(dá) 將拼接序列輸入ORF finder 預(yù)測其開放閱讀框，設(shè)計原核表達(dá)上游引物:5'-CCGGAATTCATGTCGCGCAATGCTGACGA-3'(29 bp);原核表達(dá)下游引物:5'-CCCAAGCTTTTATC CCATTGGTAGCAAGT-3'(29 bp)。以制備的cDNA 為模板，利用合成的引物采用PCR 法擴(kuò)增鹽藻細(xì)胞預(yù)測的IFT88 開放閱讀框的基因序列。PCR 反應(yīng)程序:95℃5 min;94℃30 s，40～60℃30 s，72℃150 s，30 個循環(huán);72℃10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。將PCR 產(chǎn)物膠回收，連接于pMD19-T 載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落培養(yǎng)，雙酶切鑒定后送公司測序。將測序正確的菌液質(zhì)粒回收，EcoR I、Hind Ⅲ雙酶切后，產(chǎn)物用10 g/L 瓊脂糖凝膠檢測并回收，隨后與pET28a 載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，進(jìn)行原核表達(dá)。并進(jìn)一步利用1 mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)4 h，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，觀察表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 杜氏鹽藻IFT88 基因cDNA 3'RACE 結(jié)果3'RACE 所得片段膠回收后連接于pMD19-T 得到質(zhì)粒pMD-I1，經(jīng)EcoR I、Hind Ⅲ雙酶切鑒定后(圖1)，送公司測序，測序長度約為2 275 bp。

圖1 IFT88 3'RACE 及pMD-I1 的酶切鑒定結(jié)果

2.2 杜氏鹽藻IFT88 基因cDNA 5'RACE 結(jié)果經(jīng)5'擴(kuò)增后得到一條約1 000 bp 的條帶，膠回收后與pMD19-T 載體連接得到質(zhì)粒pMD-I2，雙酶切鑒定結(jié)果見圖2，送公司測序后得到998 bp 核苷酸片段。

圖2 IFT88 5'端擴(kuò)增及pMD-I2 的酶切鑒定結(jié)果

2.3 實時熒光定量PCR 結(jié)果 結(jié)果見圖3。與未去除鞭毛組比較，在去除鞭毛后的180 min 內(nèi)，IFT88 基因的轉(zhuǎn)錄量在30 min 時達(dá)到了對照組的4倍，隨后轉(zhuǎn)錄水平迅速降低，與鹽藻鞭毛生長速率曲線基本一致。

2.4 pET28a-IFT88 載體構(gòu)建及其原核表達(dá)結(jié)果擴(kuò)增得到開放閱讀框約2 400 bp(圖4A)，公司測序結(jié)果顯示序列無誤，編碼799 個氨基酸，BLAST 顯示該氨基酸序列與多個物種的IFT88 有較高同源性。膠回收片段，與pET28a 載體連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，與pET28a 載體連接后得到質(zhì)粒pET28a-IFT88，質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果見圖4B。SDSPAGE 顯示37℃、1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)4 h 后在約90 000處有明顯高表達(dá)(圖5)。

3 討論

經(jīng)測序拼接后，得到IFT88 開放閱讀框2 400 bp，編碼799 個氨基酸，通過DNAMAN 軟件對該序列分析得到IFT88 蛋白的相關(guān)信息，其蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為87 907.4，等電點為5.08。在NCBI上比對IFT88 氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其具有IFT88 家族所特有的結(jié)構(gòu)域(TPR 結(jié)構(gòu)域)，且與其他物種的IFT88 氨基酸序列有較高的同源性(衣藻58%、斑馬魚40%、短尾負(fù)鼠40%、黑猩猩43%、人類38%)，可見此蛋白序列比較保守。

自Pazour 等［4］發(fā)現(xiàn)衣藻IFT88 小鼠同源蛋白Tg737 斷裂可以縮短腎臟纖毛并引起多囊腎病以來，關(guān)于IFT88 研究越來越多。IFT88 的缺失會導(dǎo)致纖毛缺陷，這種缺陷會導(dǎo)致多囊腎疾病、視覺、嗅覺的功能障礙等多種纖毛疾病，此外，IFT88 在細(xì)胞有絲分裂中與紡錘體的定位相關(guān)聯(lián)［8］，并且在無纖毛細(xì)胞中，IFT88 還能調(diào)節(jié)細(xì)胞G1-S 的轉(zhuǎn)變［9］。雖然關(guān)于IFT88 和纖毛疾病的研究已經(jīng)很多，但是導(dǎo)致這種病變的機(jī)制仍不清楚，并且關(guān)于纖毛的組裝、維持和解聚的機(jī)制也有待探究。作者不僅克隆了IFT88 的開放閱讀框而且構(gòu)建其原核表達(dá)載體對此蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，又通過實時熒光定量PCR 觀察在轉(zhuǎn)錄水平上IFT88 與杜氏鹽藻鞭毛再生的關(guān)系，此實驗為進(jìn)一步純化IFT88 蛋白、制備抗體及研究IFT88 在鞭毛中的相互作用奠定了基礎(chǔ)。

［1］曹木青，潘俊敏.纖毛及纖毛相關(guān)疾病研究進(jìn)展［J］.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2012，34(9):849

［2］Cole DG，Snell WJ.Snapshot:intraflagellar transport［J］.Cell，2009，137(4):784

［3］Hao L，Schole JM.Intraflagellar transport at a glance［J］.J Cell Sci，2009，122(Pt 7):889

［4］Pazour GJ，Dickert BL，Vucica Y，et al.Chlamydomonas IFT88 and its mouse homologue，polycystic kidney disease gene tg737，are required for assembly of cilia and flagella［J］.J Cell Biol，2000，151(3):709

［5］McIntyre JC，Davis EE，Joiner A，et al.Gene therapy rescues cilia defects and restores olfactory function in a mammalian ciliopathy model［J］.Nat Med，2012，18(9):1423

［6］Pazour GJ，Baker SA，Deane TA，et al.The intraflagellar transport protein，IFT88，is essential for vertebrate photoreceptor assembly and maintenance［J］.J Cell Biol，2002，157(1):103

［7］王翠，李杰，柳麗平，等.杜氏鹽藻寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3α 功能結(jié)構(gòu)域的克隆與表達(dá)分析［J］.生物工程學(xué)報，2010，26(6):760

［8］Delaval B，Bright A，Lawson ND，et al.The cilia protein IFT88 is required for spindle orientation in mitosis［J］.Nat Cell Biol，2011，13(4):461

［9］Robert A，Margall-Ducos G，Guidotti JE，et al.The intraflagellar transport component IFT88/polaris is a centrosomal protein regulating G1-S transition in non-ciliated cells［J］.J Cell Sci，2007，120(Pt 4):628