食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞及組織中鈣敏感受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測(cè)*

景坤玉，董騰慧，郭明洲，薛樂(lè)勛

1)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州450001 2)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院消化科 北京100853#通訊作者，男，1944年2月生，本科，教授，研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

食管癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其分布具有明顯的地域差異性:西方國(guó)家多為腺癌，而亞洲地區(qū)多數(shù)為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)［1-2］。食管癌具體的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，早期癥狀不典型，多數(shù)患者錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)期。因此，篩選針對(duì)食管癌的早期診斷標(biāo)志物是改善患者生存質(zhì)量與預(yù)后的關(guān)鍵。抑癌基因的表觀遺傳學(xué)改變，尤其是啟動(dòng)子區(qū)域的異常高甲基化所導(dǎo)致的基因沉默，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在食管癌的早期病變組織中已經(jīng)檢測(cè)到了多個(gè)基因的甲基化異常改變。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CASR)屬G 蛋白耦聯(lián)受體家族成員，定位于染色體3q13，廣泛分布于甲狀旁腺、腎臟、骨和腸等組織，對(duì)機(jī)體Ca2+穩(wěn)態(tài)的維持起關(guān)鍵作用。CASR 的表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如甲狀旁腺腺瘤、乳癌、前列腺癌與結(jié)腸癌等［3-4］。已有報(bào)道［5］證實(shí)其在食管組織及正常食管上皮細(xì)胞系中均有表達(dá)，但是在食管癌中甲基化狀態(tài)與表達(dá)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究探討了CASR基因在食管癌中啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的改變，以期尋找食管癌潛在的早期診斷標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選用的6 株食管癌細(xì)胞系(TE8、BIC1、KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE510)及正常人外周血淋巴細(xì)胞均來(lái)自中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院消化科實(shí)驗(yàn)室，除BIC1 為食管腺癌外，其余5 株均為ESCC 細(xì)胞系。68例食管癌組織標(biāo)本取自2011年7月至2012年7月安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除新鮮標(biāo)本，迅速凍于液氮罐內(nèi)，后轉(zhuǎn)至－80℃儲(chǔ)存。其中男53例，女15例;年齡43～78(62.1±8.1)歲，＜60 歲27例，≥60 歲41例;腫瘤位置分別為胸上段20例，胸中段36例，胸下段12例;臨床TNM分期依據(jù)1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、Ⅱ期共50例，Ⅲ、Ⅳ期共18例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例;術(shù)前未經(jīng)放化療。8例正常食管黏膜組織作為對(duì)照，取自于中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心非腫瘤患者活檢標(biāo)本。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷(5-Aza)體外去甲基化處理 6 株食管癌細(xì)胞株均在添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(Gbico 公司)及100 kU/L 青霉素、0.1 g/L 鏈霉素(山東魯抗制藥)的RPMI 1640 培養(yǎng)基(Gbico 公司)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到培養(yǎng)瓶底面積70%～80% 融合時(shí)，消化收集細(xì)胞，提取DNA 及RNA。根據(jù)KYSE30、KYSE140、KYSE510 的生長(zhǎng)狀況，取部分細(xì)胞接種于75 mL 的培養(yǎng)瓶中過(guò)夜，向培養(yǎng)基中加入5-Aza(Sigma 公司)至終濃度為2 μmol/L，體外誘導(dǎo)去甲基化。每24 h 更換1 次培養(yǎng)基，96 h 后提取總RNA。

1.3 組織及細(xì)胞DNA 與總RNA 的提取 食管癌組織及細(xì)胞系的DNA 提取采用蛋白酶K(Sigma 公司)裂解，酚氯仿法抽提，乙醇沉淀后溶于TE 緩沖液。細(xì)胞系總RNA 提取采用Trizol(Invitrogen 公司)試劑，在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)提取，紫外分光光度計(jì)［A(260nm)/A(280nm)］檢測(cè)濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸質(zhì)量，經(jīng)篩選后分別保存于－20℃(DNA)與－80℃(RNA)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA 樣本的亞硫酸氫鹽修飾及甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)檢測(cè) 取2 μg 的DNA 樣本用亞硫酸氫鹽處理，經(jīng)DNA Wizard純化試劑盒(Promega 公司)回收，其堿基序列中甲基化的C 不發(fā)生改變，非甲基化的C 轉(zhuǎn)變?yōu)閁。依據(jù)序列的不同設(shè)計(jì)針對(duì)CASR 基因啟動(dòng)子區(qū)的特異性甲基化引物:CASR-MF，5'-GGTTCGGGTTTTTAAG TAGC-3';CASR-MR，5'-TCAAACGTTACCTATACCG C-3';以及非甲基化特異性引物:CASR-UF，5'-TTAG GTTTGGGTTTTTAAGTAGT-3';CASR-UR，5'-TCAAA CATTACCTATACCACAAA-3'，產(chǎn)物大小166 bp。以修飾后DNA 樣本為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)CASR 基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀況。MSP 反應(yīng)條件為:95℃5 min;95℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，35個(gè)循環(huán);72℃7 min。以體外甲基化DNA(in vitro methylated DNA，IVD)作為甲基化陽(yáng)性對(duì)照，以正常人外周血淋巴細(xì)胞(normal lymphocyte，NL)DNA 作為陰性對(duì)照，以滅菌雙蒸水作為空白對(duì)照。

1.5 MSP 結(jié)果判定 取MSP 擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，20 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。判定原則:若非甲基化引物CASR-U 擴(kuò)增出條帶，而甲基化引物CASRM 未擴(kuò)增出條帶，則說(shuō)明未發(fā)生甲基化;若甲基化引物CASR-M 擴(kuò)增出條帶，而非甲基化引物CASRU 未擴(kuò)增出條帶，則說(shuō)明發(fā)生完全甲基化;若2 種引物均擴(kuò)增出條帶，即說(shuō)明存在部分甲基化。部分甲基化與完全甲基化均認(rèn)為CASR 啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化。

1.6 半定量RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞系5-Aza 處理前后CASR mRNA 的表達(dá)取5 μg 總RNA 用cDNA 第一鏈合成試劑盒(Invitrogen 公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋5 倍后取2.5 μL 為模板行RT-PCR。CASR 引物 序 列:CASR-F， 5'-CGGGGTACCTTAAGCAC CTACGGCATCTAA-3';CASR-R，5'-GCTCTAGAGT TAACGCGATCCCAAAGGGCTC-3'，產(chǎn)物大小480 bp。以GAPDH 作為內(nèi)參，GAPDH 引物序列:GAPDH-F，5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3';GAPDH-R，5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產(chǎn)物大小454 bp。以滅菌雙蒸水為空白對(duì)照。CASR 擴(kuò)增條件:95℃5 min;95℃30 s，56℃30 s，72℃40 s，38 個(gè)循環(huán);72℃5 min。最后取10 μL 的RT-PCR 產(chǎn)物，20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，ESCC 患者的年齡、性別、腫瘤位置、臨床TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征與CASR 啟動(dòng)子區(qū)甲基化的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或校正χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CASR 在食管癌細(xì)胞系中的甲基化狀態(tài) 6株細(xì)胞系MSP 結(jié)果顯示:CASR 基因啟動(dòng)子區(qū)在KYSE30、KYSE70、KYSE140、TE8、BIC1 中均發(fā)生甲基化，而在KYSE510 中未發(fā)生甲基化(圖1)。

圖1 CASR 基因啟動(dòng)子區(qū)在食管癌細(xì)胞系中的甲基化狀態(tài)

2.2 5-Aza 去甲基化處理對(duì)CASR 在食管癌細(xì)胞系中表達(dá)的調(diào)控 半定量RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，在發(fā)生甲基化的食管癌細(xì)胞系KYSE30 與KYSE140中，處理前CASR 表達(dá)缺失，而5-Aza 處理96 h 后其表達(dá)恢復(fù);在未發(fā)生甲基化的細(xì)胞系KYSE510 中，5-Aza 處理前后表達(dá)水平無(wú)差異(圖2)。

2.3 CASR 在ESCC組織中的甲基化狀態(tài)及其與臨床病理特征的關(guān)系

2.3.1 CASR 在ESCC組織中的甲基化狀態(tài) MSP檢測(cè)結(jié)果顯示，ESCC組織中48例存在甲基化，甲基化率為71%(48/68)，而正常食管黏膜組織中CASR均未檢測(cè)到甲基化(0/8)(圖3)。

2.3.2 CASR 的甲基化狀態(tài)與ESCC 患者臨床病理特征的關(guān)系 CASR 啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與ESCC患者的年齡構(gòu)成、性別、腫瘤位置、腫瘤TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等均無(wú)關(guān)(表1)。

表1 CASR 啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

食管癌的具體發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，近來(lái)發(fā)現(xiàn)抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島高甲基化導(dǎo)致的表觀遺傳沉默，涉及細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、黏附及DNA 損傷修復(fù)等多個(gè)相關(guān)基因的異常表達(dá)，可導(dǎo)致抗腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的紊亂［6］，與多種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［7-12］。先前的研究［8，10，12-14］已發(fā)現(xiàn)多個(gè)在食管癌組織中頻繁發(fā)生甲基化的抑癌基因:如PTK6、HIN-1、TFPI-2、SST 和XAF1 等，提示食管癌的發(fā)生發(fā)展與表觀遺傳學(xué)尤其是DNA 甲基化的漸進(jìn)性改變密切相關(guān)。該研究通過(guò)MSP 技術(shù)分析食管癌的表觀遺傳修飾規(guī)律和特點(diǎn)，以期為尋求和發(fā)現(xiàn)潛在的腫瘤標(biāo)志物與早期診斷策略奠定基礎(chǔ)［15］。

CASR 基因定位于染色體3q13，是G 蛋白耦聯(lián)受體家族成員，廣泛分布于甲狀旁腺、腎臟、心臟、腸和食管等器官，在維持機(jī)體Ca2+及其他金屬離子穩(wěn)態(tài)中起重要作用，其異常表達(dá)與甲狀旁腺腺瘤、乳癌、前列腺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［3］。Hizaki 等［4］研究發(fā)現(xiàn)CASR 基因啟動(dòng)子區(qū)頻繁甲基化導(dǎo)致其表達(dá)降低或沉默;Liu 等［16］報(bào)道維生素D 對(duì)于結(jié)腸癌的抑制作用依賴CASR 的功能，提示其可能成為食管癌早期診斷、分子靶向治療、化療敏感性或預(yù)后等方面重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，可通過(guò)去甲基化藥物進(jìn)行表觀遺傳臨床治療逆轉(zhuǎn)其表達(dá)。

因此，探討食管癌組織中CASR 的甲基化改變，有助于篩選針對(duì)食管癌的早期診斷標(biāo)志物，開(kāi)發(fā)組織特異性的治療新方法以及降低抗腫瘤藥物的不良反應(yīng)，更有效地選擇應(yīng)對(duì)食管癌的策略。

作者利用食管癌細(xì)胞系探討CASR mRNA 表達(dá)與甲基化之間的關(guān)系，檢測(cè)了食管正常黏膜組織與ESCC組織中CASR 啟動(dòng)子區(qū)CpG 島的甲基化狀態(tài)，并分析甲基化與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示5 株食管癌細(xì)胞系CASR 啟動(dòng)子區(qū)CpG 島發(fā)生甲基化，KYSE30、KYSE140 中CASR 表達(dá)缺失，去甲基化藥物5-Aza 處理96 h 后恢復(fù)表達(dá);KYSE510 藥物處理前后均正常表達(dá)，與甲基化狀態(tài)相對(duì)應(yīng)，提示在食管癌細(xì)胞系中CASR 啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化并且其表達(dá)受到甲基化的調(diào)控。68例ESCC組織中CASR 頻繁發(fā)生甲基化，甲基化率為71%，8例正常食管黏膜組織中沒(méi)有發(fā)生甲基化，提示CASR 甲基化具有腫瘤相關(guān)性，而排除組織特異性。結(jié)合臨床病理特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CASR 甲基化與ESCC 患者年齡、性別、臨床TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，推測(cè)CASR 啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化可能是ESCC 發(fā)生的早期事件，與腫瘤的惡性程度無(wú)關(guān)。

綜上所述，該研究證實(shí)CASR 在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)受到了啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)控，其導(dǎo)致的表達(dá)沉默可能與食管癌的發(fā)生相關(guān)。CASR 的啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是ESCC組織中頻繁發(fā)生的早期事件，其甲基化率高于多數(shù)在食管癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用的基因，可能作為食管癌前病變或ESCC 早期篩查的一個(gè)潛在標(biāo)志物，對(duì)于ESCC 的防治或者預(yù)測(cè)ESCC 發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

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