植物病原菌拮抗性野生艾蒿內(nèi)生菌的分離、篩選和鑒定

徐亞軍，趙龍飛，*，陳 普，蔣曉瑞，韋革宏

(1.商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南省高校植物與微生物互作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省高校生物質(zhì)降解與氣化工程技術(shù)研究中心，商丘 476000;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100)

野生艾蒿(Artemisia argyi Levl.et Vant)是一種菊科(Asteraceae)多年生半灌木狀草本藥用植物，在我國(guó)的東北、華北、華東、華南、西南以及陜西及甘肅等地區(qū)都有廣泛的分布。在干旱、半干旱的高溫條件下，由于艾蒿類(lèi)植物有很強(qiáng)的適應(yīng)性，尤其具有耐風(fēng)蝕、耐高溫、抗嚴(yán)寒，加之具有較高的生物量、根系粗壯、木質(zhì)化、水平根系發(fā)達(dá)等特點(diǎn)，是一種優(yōu)良的水土保持植物，對(duì)生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和恢復(fù)起到非常重要的作用。

艾蒿中主要化學(xué)成分為揮發(fā)油類(lèi)、黃酮類(lèi)、桉葉烷類(lèi)和三萜類(lèi)等化合物，對(duì)其活性研究表明，艾蒿中的黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化、清除自由基、抗癌和抑菌等多種生物活性［1］。對(duì)野生艾蒿資源開(kāi)發(fā)已有許多研究，孫天竹［2］對(duì)野生艾蒿的色素提取方法、穩(wěn)定性測(cè)試及提高色素穩(wěn)定性進(jìn)行了研究;顧小衛(wèi)［3］研究了野生艾蒿中如何提取揮發(fā)油，張玲春［4］等測(cè)定了艾蒿粗提物對(duì)甜菜夜蛾的胃毒作用，以及與其它藥劑及幾種增效劑的聯(lián)合作用;艾蒿莖、葉的水浸提液對(duì)冰草和披堿草幼苗芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)具有顯著的化感作用［5］。利用水浸提法制得的艾蒿提取液對(duì)大腸桿菌［6］、金黃色葡萄球菌［7］進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明對(duì)兩種病原細(xì)菌都有很好的抑制活性。

植物內(nèi)生菌(Endophyte)是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于植物的各種組織和器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的微生物，是一種重要的微生物資源，也是新型天然活性物質(zhì)的重要來(lái)源之一。目前，已報(bào)道在各種農(nóng)作物及經(jīng)濟(jì)作物中發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)生細(xì)菌有革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性桿菌，分屬于54個(gè)屬的129種，除根瘤菌外，大多為土壤微生物種類(lèi)，其中假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類(lèi)芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)以及土壤桿菌屬(Agrobacterium)、泛菌屬(Pantoea)、固氮菌屬(Diazotrophicus)等最為常見(jiàn)，這些內(nèi)生菌幾乎存在植物的所有組織中。植物內(nèi)生菌侵入寄主植物后，不易受環(huán)境條件的影響，具有穩(wěn)定的生存空間，可在其中定殖和運(yùn)轉(zhuǎn)。其中，一些植物內(nèi)生菌是很好的生防資源，它們的防病機(jī)理主要表現(xiàn)在通過(guò)產(chǎn)生抗生素類(lèi)、水解酶類(lèi)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和生物堿類(lèi)物質(zhì)，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或空間，增強(qiáng)宿主植物的抵抗力以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等途徑抑制病原菌生長(zhǎng)［8］。

在特定的環(huán)境和生理?xiàng)l件下，內(nèi)生菌不僅能脅迫促進(jìn)寄主植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的形成和累積，而且自身也可產(chǎn)生與宿主相同或不同的生理活性物質(zhì)［9］。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)藥用植物艾蒿的研究多集中在生物學(xué)特性上［10］，但對(duì)該植物內(nèi)生細(xì)菌資源的研究相對(duì)較少。由于內(nèi)生菌和宿主經(jīng)長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化形成了互惠互利的關(guān)系，二者在代謝和理化方面存在密切的合作。其內(nèi)生菌的抑菌能力是否因?yàn)槭艿街参锾厥鉅I(yíng)養(yǎng)成分刺激而加強(qiáng)，目前相關(guān)報(bào)道還很有限，因此系統(tǒng)地研究艾蒿內(nèi)生菌資源，探索其對(duì)當(dāng)?shù)刂参锊≡婢霓卓棺饔?，篩選有抑菌活性的內(nèi)生菌，為進(jìn)一步研發(fā)生物接菌劑、生物防治劑和維持生態(tài)平衡提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生艾蒿于2012年5月份采自河南省商丘市梁園區(qū)西部郊區(qū)荒地。植株處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，植株周?chē)须s草生長(zhǎng)。采樣地地理坐標(biāo)為:N34°25—36'、E115°37—40'，海拔52m，地勢(shì)平坦，排水狀況良好，土壤干燥，系沙壤土，pH7.8。

植物病原菌:棉花枯萎病菌FO101(Fusarium oxysporum)、稻瘟病菌MG102(Magnaporthe grisea)、煙草赤星病菌AA103(Alternaria alternata)由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)教研室惠贈(zèng)，以菌核的形式保藏在-70℃冰箱中，傳代培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，28℃培養(yǎng)2d。

1.2 方法

1.2.1 野生艾蒿內(nèi)生菌的分離、純化

組織表面消毒參考文獻(xiàn)［11-12］，內(nèi)生菌分離和純化采用平板涂布法，平板上長(zhǎng)出的單菌落經(jīng)染色、鏡檢，保藏于試管斜面中備用。

1.2.2 抑菌活性測(cè)定

對(duì)內(nèi)生菌抑菌活性的初篩、復(fù)篩采用對(duì)峙法［13］。抑菌率按照公式計(jì)算，抑菌率=［(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑］×100%。初篩出優(yōu)良菌株進(jìn)行復(fù)篩，過(guò)程如初篩，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 微生物生理生化特性、菌落特征和細(xì)胞形態(tài)特征的測(cè)定

按照東秀珠［14］方法對(duì)所分離的菌株進(jìn)行生理生化特性、形態(tài)特征、革蘭氏染色、芽孢染色和菌體大小等指標(biāo)的測(cè)試。

1.2.4 16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用細(xì)菌基因組DNA試劑盒OSR-M502(天根生化科技有限公司生產(chǎn))提取細(xì)菌基因組DNA，并以之為模板，進(jìn)行16S rDNA的擴(kuò)增。所用引物、擴(kuò)僧體系、反應(yīng)條件見(jiàn)參考文獻(xiàn)［13］，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將擴(kuò)增得到的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，用DNAMAN6.0進(jìn)行序列相似性分析，通過(guò)Clustal-X1.81和TREECONW軟件(version 1.3b)，以Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用Bootstrap(1000次重復(fù))進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2.5 病原菌菌絲的顯微觀察

把菌落直接放置于倒置顯微鏡的載物臺(tái)，觀察處理菌株和對(duì)照菌株菌絲體的形態(tài)變化，記錄并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

從根、莖、葉中分離到的內(nèi)生菌，分別對(duì)棉花枯萎病菌、稻瘟病菌、煙草赤星病菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，初篩結(jié)果(表1)表明:對(duì)3種植物病原菌具有抑制作用的內(nèi)生菌的數(shù)量分布上差別不大，而野生艾蒿內(nèi)生菌中對(duì)不同病原真菌有抑制作用的數(shù)量存在差異。由此可見(jiàn)，對(duì)不同植物病菌來(lái)說(shuō)，同一種植物內(nèi)有抑菌作用的內(nèi)生菌的抑菌廣譜性方面存在差異。

表1 根莖葉部位對(duì)植物病原菌有抑菌作用內(nèi)生菌的數(shù)量及所占比例Table 1 The number and percent of inhibiting endophytes from different parts of plant to pathogenic bacteria

2.2 復(fù)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

圖1 分離菌株R6對(duì)棉花枯萎病菌FO101的抑制作用(左圖為對(duì)照)Fig.1 Fusarium oxysporum FO101 inhibited by endophyte R6(Left:control)

圖2 分離菌株S11對(duì)煙草赤星病菌AA103的抑制作用(左圖為對(duì)照)Fig.2 Alternaria alternata AA103 inhibited by endophyte S11(Left:control)

表2 內(nèi)生菌對(duì)棉花枯萎病菌的抑菌效果Table 2 Inhibition effect of endophytes to Fusarium oxysporum

分別篩選出抑菌現(xiàn)象明顯(抑菌率達(dá)20%以上)(圖1、圖2)的菌株進(jìn)行復(fù)篩。每個(gè)平板做3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)72h后分別測(cè)定菌落直徑大小，取3個(gè)重復(fù)的平均值，代入抑菌率計(jì)算公式，計(jì)算抑菌率的大小(表2、表3和表4)。來(lái)自于莖部的內(nèi)生菌有4株，對(duì)棉花枯萎病有明顯的抑制作用，抑菌率均達(dá)到17%以上，最大抑菌率為28.24%;葉片分離的內(nèi)生菌有2株，對(duì)棉花枯萎有明顯的抑制作用，最大達(dá)26.78%;根部分離的內(nèi)生菌有1株，對(duì)棉花枯萎的抑制作用最為明顯，抑菌率達(dá)到32.61%。對(duì)比分離自根部、莖部和葉片的內(nèi)生菌對(duì)棉花枯萎病菌的抑菌率發(fā)現(xiàn)，在P＜0.05水平上存在明顯的差異。由此可見(jiàn)，不同部位內(nèi)生菌對(duì)棉花枯萎病的抑菌效果表現(xiàn)為:根部＞莖部＞葉片。

表3 內(nèi)生菌對(duì)稻瘟病菌的抑菌效果Table 3 Inhibition effect of endophytes to Magnaporthe grisea

來(lái)自于莖部的內(nèi)生菌有9株，對(duì)稻瘟病有明顯的抑制作用，抑菌率均達(dá)到20%以上，最大抑菌率為36.30%;葉片分離的內(nèi)生菌有7株對(duì)稻瘟病有明顯的抑制作用，抑菌率達(dá)到24%以上，最大抑菌率為39.28%;根部分離的內(nèi)生菌有4株，對(duì)稻瘟病有明顯的抑制作用，抑菌率達(dá)到21%以上，最大抑菌率為37.98%。對(duì)比分離自根部、莖部和葉片的內(nèi)生菌對(duì)稻瘟病的抑菌率發(fā)現(xiàn)，在P＜0.05水平上存在明顯的差異。由此可見(jiàn)，不同部位內(nèi)生菌對(duì)稻瘟病的抑菌效果表現(xiàn)為:葉片＞根部＞莖部。

來(lái)自于莖部的內(nèi)生菌有4株，對(duì)煙草赤星有明顯的抑制作用，抑菌率均達(dá)到25%以上，最大抑菌率為32.10%;葉片分離的內(nèi)生菌有2株，對(duì)煙草赤星有明顯的抑制作用，抑菌率達(dá)到27%以上，最大抑菌率為31.20%;根部分離的內(nèi)生菌有1株，對(duì)煙草赤星有明顯的抑制作用，最大抑菌率為25.04%。對(duì)比根部、莖部和葉片的內(nèi)生菌對(duì)稻瘟病的抑菌率發(fā)現(xiàn)，在P＜0.05水平上存在明顯的差異。由此可見(jiàn)，不同部位內(nèi)生菌對(duì)煙草赤星的抑菌效果表現(xiàn)為:莖部＞葉片＞根部。

表4 內(nèi)生菌對(duì)煙草赤星的抑菌作用結(jié)果Table 4 Inhibition effect of endophytes to Alternaria alternate

對(duì)棉花枯萎病抑菌效果最為明顯的是來(lái)自根部的菌株R6(其抑制率為32.61%)，對(duì)稻瘟病抑菌效果最為明顯的為分離自葉片的菌株L8(其抑制率為39.28%)，對(duì)煙草赤星抑菌效果最為明顯的是分離自莖部的菌株S11(其抑制率為32.10%)?？梢?jiàn)，分離自野生艾蒿的內(nèi)生菌對(duì)不同植物病原菌的抑菌效果存在差異，稻瘟病＞棉花枯萎?。緹煵莩嘈?。

2.3 菌株的初步鑒定

復(fù)篩中對(duì)3種病原菌抑制作用較強(qiáng)的菌株R6、L8和S11進(jìn)行平板培養(yǎng)，經(jīng)2d培養(yǎng)，平板菌落特征為:菌落均濕潤(rùn)、不透明、易挑起、生長(zhǎng)速度快，菌落正反面顏色一致，菌落邊緣不整齊或呈缺刻狀。其中，菌株R6和L8菌落外觀呈扁平狀，乳白色、表面有光澤;菌株S11外觀平坦，白色、表面無(wú)光澤。3株菌的菌落直徑各異(R6:2.5mm、L8:3.0mm、S11:2.0mm)。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征和生理生化特性試驗(yàn)結(jié)果(表5)，結(jié)合東秀珠等編的《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)和鑒定手冊(cè)》［14］，菌株R6、L8和S11均初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株。

表5 菌株R6、L8、S11的生理生化試驗(yàn)結(jié)果和細(xì)胞特征Table 5 Physiological and biochemical test results and cell characteristics of strain R6，L8 and S11

2.4 菌株16S rDNA序列擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

篩選出3株菌的16S rDNA序列經(jīng)PCR擴(kuò)增表明，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度大約為1.5kb。其在GenBank中的序列登記號(hào)為KC245140-KC245142。將菌株的序列與模式菌種序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，菌株L8與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株 NRRL NRS-744T的序列 EU138520相似率最大，達(dá)98.7%，該菌株與菌株 Bacillus subtilis NRRL NRS-744T位于同一系統(tǒng)發(fā)育分支上，結(jié)合其生理生化特性和培養(yǎng)特征，該菌株屬于芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌。菌株S11與模式菌株Bacillus cereus ATCC14579T(AF290547)位于同一發(fā)育分支上，二者具有最大的相似率，達(dá)99.3%;菌株R6與模式菌株P(guān)aenibacillus polymyxa IAM13419T(D16276)同一發(fā)育分支上，且二者間相似率最大，達(dá)99.1%(圖3)。結(jié)合菌株S11和R6的生理生化特征以及培養(yǎng)特征，這兩個(gè)菌株分別屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)和多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。

表6 測(cè)序菌株的分類(lèi)鑒定結(jié)果Table 6 Classification and Identification of the tested strains

圖3 篩選菌株的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分支上的數(shù)值表示大于50%的自舉值，括號(hào)里是GenBank登陸號(hào)，粗體是待測(cè)菌株，標(biāo)尺指核苷酸替代數(shù))Fig.3 Phylogenetic tree generated by the neighbor-joining method based on 16S rDNA sequences of selected strains.Bootstrap values(1000 replicates)are indicated above the branches.Strains obtained are labeled in bold.Bar:0.02 sequence divergence

2.5 病原菌菌絲的被抑制作用

內(nèi)生菌與病原菌的拮抗培養(yǎng)中，兩菌的菌落從未接觸，而病原菌靠近內(nèi)生菌的菌落邊緣部分不但有萎縮現(xiàn)象，而且出現(xiàn)黑色壞死部分，鏡檢結(jié)果顯示，正常生長(zhǎng)的植物病原菌菌絲粗細(xì)均勻一致、粗壯、光滑，生長(zhǎng)端菌絲舒展(圖4A，D)。棉花枯萎病菌的受作用菌絲(圖4B，C)可以看出:有的菌絲發(fā)生波浪形扭曲、畸變(圖4B-g)，有的菌絲打結(jié)(圖4C-h)?？赡苁莾?nèi)生菌R6通過(guò)分泌某種活性物質(zhì)對(duì)菌絲發(fā)揮作用，一方面溶解病原菌的細(xì)胞壁;一方面抑制病原菌的正常生長(zhǎng)、代謝以致萎縮、畸變。煙草赤星病原菌的受作用菌絲生長(zhǎng)端分枝明顯增多、分枝間隔變短(圖4F)，菌絲扭曲(圖4F-c)，生長(zhǎng)邊緣呈珊瑚狀枝(圖4F-d)，并且有的菌絲斷裂，在斷裂處出現(xiàn)了明顯的球狀膨大現(xiàn)象(圖4E-b;圖4F-e);有的菌絲因細(xì)胞壁被消解而變得透明(圖4E-a)，還有些菌絲變細(xì)、變暗，原生質(zhì)濃縮(圖4F-f)

3 結(jié)論和討論

圖4 艾蒿內(nèi)生菌R6、S11對(duì)植物病原菌發(fā)生抑制作用時(shí)菌絲的變化(A.棉花枯萎病菌FO101的正常菌絲;B，C.棉花枯萎病菌FO101菌絲的畸形、彎曲打結(jié)菌絲;D.煙草赤星病菌AA103的正常菌絲;E F.煙草赤星病菌AA103菌絲的自溶、斷裂萎縮)Fig.4 Mycelia change of plant pathogenic fungi under inhibition of Artemisia argyi endophytes A.Normal mycelia of Fusarium oxysporum FO101;B，C.Deformity，bending knot mycelia of Fusarium oxysporum FO101;D.Normal mycelia of Alternaria alternate AA103;E、F.Autolysis，fracture and atrophy of Alternaria alternate AA103

3.1 通過(guò)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，不同菌株對(duì)病原菌的抑制情形各異。稻瘟病菌和煙草赤星病菌受到抑制后有明顯的抑菌區(qū)域，但內(nèi)生菌和病原菌均未接觸，可能是由于內(nèi)生菌的生長(zhǎng)速度快，占據(jù)營(yíng)養(yǎng)空間，對(duì)病原菌形成營(yíng)養(yǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)，使病原真菌因缺乏營(yíng)養(yǎng)而萎縮、畸變［15］;也可能是在培養(yǎng)的過(guò)程中內(nèi)生菌產(chǎn)生的水解酶類(lèi)［15］(細(xì)胞壁水解酶、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶等)降解了病原真菌細(xì)胞壁，或產(chǎn)生了其他致病因子如毒素等，對(duì)病原真菌發(fā)揮作用的結(jié)果［16］。棉花枯萎病受到抑制后菌絲發(fā)生扭曲和貼壁現(xiàn)象(圖4B，C)，可能是在培養(yǎng)的過(guò)程中內(nèi)生菌產(chǎn)生了化感物質(zhì)［15］，如螯合型鐵載體、抗生素、殺菌性揮發(fā)物、溶菌酶和解毒酶等。如果產(chǎn)生鐵載體可奪取生長(zhǎng)于同一培養(yǎng)基上病原菌生長(zhǎng)必需的鐵元素，有效阻礙了病原菌菌絲的正常生長(zhǎng)和發(fā)育;也許是內(nèi)生菌產(chǎn)生抗生素類(lèi)物質(zhì)［15］如寡霉素A、卡那霉素水解物、雙效菌素A等對(duì)病原菌菌絲發(fā)生抑制作用、導(dǎo)致菌絲畸形發(fā)展，前端變得萎縮、基部多呈珊瑚狀分枝(圖4F);若是產(chǎn)生溶菌酶如胞外幾丁質(zhì)酶和昆布糖酶對(duì)病原菌絲消化、溶解，導(dǎo)致菌絲外壁因部分溶解而發(fā)生打折、透明(圖4E-i，a)，抑制病菌的正常生長(zhǎng)［17］。易龍等［18］研究支持了這個(gè)解釋?zhuān)瑹煵輧?nèi)生細(xì)菌Itb162對(duì)煙草赤星病原菌菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，主要是拮抗菌使病原菌菌絲形成膨脹泡，破裂、消解，致使菌絲停止生長(zhǎng)。蛋白酶和其他生物控制特性也參與對(duì)菌核病以及灰霉病菌生長(zhǎng)的抑制作用［19］。類(lèi)芽孢桿菌也可產(chǎn)生的β-1，3-葡聚糖酶可酶解枯萎病菌的細(xì)胞壁，導(dǎo)致菌絲自溶、斷裂［20］;也可能是多種機(jī)制的結(jié)合。但具體抑制機(jī)理仍在進(jìn)一步研究之中。

3.2 本研究中從艾蒿植株不同部位分離的對(duì)病原菌具有較強(qiáng)抑制活性的3株內(nèi)生菌，結(jié)合生理生化特性和培養(yǎng)特征，經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序、比對(duì)，菌株L8、S11、R6分別屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)和多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。芽孢桿菌屬菌株是最普遍被報(bào)道的植物生長(zhǎng)促生根際細(xì)菌(PGPR)，芽孢桿菌屬的一些種能夠產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物(如多肽類(lèi)物質(zhì))，對(duì)植物病原菌(細(xì)菌、真菌、線蟲(chóng)等)具有較強(qiáng)的抑菌活性［17］，可用于生物防治。如多粘類(lèi)芽孢桿菌在厭氧條件下，大多數(shù)菌株能固定氮?dú)?，?duì)人和動(dòng)植物沒(méi)有致病性，是重要的生防微生物，越來(lái)越多的拮抗性多粘類(lèi)芽孢桿菌被分離篩選出來(lái)，能夠產(chǎn)生抗菌素、抗菌蛋白、多粘菌素羊毛硫抗生素、多肽類(lèi)gavaserin和saltavalin等多種生物活性物質(zhì)［21］，以及產(chǎn)生多種水解酶類(lèi)(如β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶)對(duì)病原真菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性。已有試驗(yàn)表明，多粘類(lèi)芽孢桿菌對(duì)小麥全蝕病、由真菌尖孢鐮刀菌引起的植物枯萎病都表現(xiàn)出很好的抑制效果，并且，也能對(duì)芝麻出苗前后易出現(xiàn)的立枯病、絲核菌引起的大豆碳腐病也有控制效果。顯微鏡研究表明，對(duì)病原菌的控制效應(yīng)主要表現(xiàn)在對(duì)菌絲的腐蝕、溶解，抑制孢子萌發(fā)和產(chǎn)生分子量4517Da的抗真菌蛋白［22］。枯草芽孢桿菌也是一種重要的內(nèi)生細(xì)菌，用其來(lái)防治真菌病害已有很多報(bào)道。如利用枯草芽孢桿菌防治立枯絲核菌、腐霉菌、鐮刀菌等引起的病害，對(duì)水稻紋枯病、白葉枯病、條斑病、稻瘟病和惡苗病均有顯著的防治效果［23］。由于芽孢桿菌屬菌株具有芽孢特性，對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)，把枯草芽孢桿菌和其他芽孢桿菌屬的菌株用于種子包衣來(lái)防治植物疾病的發(fā)生，用于生物肥料和生物菌劑均具特殊的穩(wěn)定性。因此，利用野生艾蒿植株的內(nèi)生芽孢桿菌開(kāi)發(fā)生物防治劑，抑制植物病原菌、維持生態(tài)平衡具很大的應(yīng)用潛力。

3.3 植物內(nèi)生菌由于長(zhǎng)期與植物共生，相互間存在密切的聯(lián)系。野生艾蒿浸提物對(duì)病原菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌［5］的抑制作用得以證實(shí)，但對(duì)不同植物病原真菌來(lái)說(shuō)，艾蒿內(nèi)生菌所產(chǎn)生的抑菌作用廣譜性和抑菌效果方面存在差異，此外，分離自野生艾蒿不同部位的內(nèi)生菌對(duì)不同植物病原菌的抑制效果間也存在差異。這可能與藥用植物艾蒿不同組織部位的內(nèi)含化學(xué)成分［2］(揮發(fā)油、黃酮、桉葉烷和三萜類(lèi)化合物等)的含量有關(guān)，植株不同部位的內(nèi)生菌受其內(nèi)含成分的影響，內(nèi)生菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物的量和種類(lèi)可能存在差異。但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

致謝:感謝商丘師范學(xué)院賴(lài)心河博士和張富強(qiáng)博士對(duì)寫(xiě)作給予的幫助。

［1］ Sun F，Zhang K C.Study on total content and antioxidation property of flavone in agrestal Artemisia argy.Chinese Wild Plant Resources，2009，28(3):58-61.

［2］ Sun T Z，Bai R X，Hai H.The extraction and the stability of natural pigment from Mugwort.Journal of Dalian Nationalities University，2004，6(5):43-45.

［3］ Gu X W，Lv Z Y，Guo P，Xu W.Analysis of the chemical constituents of the volatile oil of Artemisia Argyi Levl.et Vant in Jiangsu.Journal of Beijing Union University(Natural Sciences)，2010，24(2):35-39.

［4］ Zhang L C，Li G Q，Liu Z W.The influence of extracts from Artemisia argyi Levl.et Vent on the oviposition of Spodoptera exigua Hübner.Journal of Nanjing Agricultural University，2002，25(4):110-112.

［5］ Liu G X，Wang J，Wang Q Q，Ma Y Y.Allelopathic effects of Artemisia argyi water extracts on the seed germination and seedling growth of Agropyron cristatum and Elymus dahuricus.Journal of Hebei University(Natural Science Edition)，2012，32(1):81-86.

［6］ Xu Y J，Zhao L F.Study on inhibitory activities of the extract from field Artemisia argyi to Escherichia coli.Jiangsu Agricultural Sciences，2012，40(4):306-308.

［7］ Zhao LF.Study on inhibitory activities of the extract from field Artemisia Argyi to Staphylococcus Aureus.The Food Industry，2011，32(6):7-8.

［8］ Shi J Y，Chen W X，Liu A Y.Advances in the study of endophytes and their effects on control of plant diseases.Acta Ecologica Sinica，2006，26(7):2395-2401.

［9］ Liu J H，Wu L F，Zhang H W.Isolation and preliminary identification of endophytes from Artemisia Annua Linn.Amino Acids＆ Biotic Resources，2011，33(4):27-3.

［10］ Wang H，Xie YS，Yang YL，Chuai JF.Allelopathic effect of extracts from Artemisia sacrorum leaf and stem on four dominant plants of enclosed grassland on Yunwu Mountain.Acta Ecologica Sinica，2011，31(20):6013-6021.

［11］ Ma Ying，Mani Rajkumar，Yong ML，Helena Freitas.Inoculation of endophytic bacteria on host and non-host plants Effects on plant growth and Ni uptake.Journal of Hazardous Materials，2011，195:30-237.

［12］ Miller K I，Chen Q，Man-Yuen S D，Roufogalis B D，Neilan B A.Culturable endophytes of medicinal plants and the genetic basis for their bioactivity.Microbial Ecology，2012，64(2):431-449.

［13］ Zhao L F，Xu Y J，Sun R，Deng Z S，Yang W Q，Wei G H.Identification and characterization of the endophytic plant growth prompter Bacillus cereus strain MQ23 isolated from Sophora alopecuroides root nodules.Brazilian Journal of Microbiology，2011，42(2):567-575.

［14］ Dong X Z，Cai M Y.Manual of systematic determination of common bacteria.Beijing:Science Press，2001.

［15］ Compant S，Duffy B，Nowak J，Clement C，Barka E A.Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases:principles，mechanisms of action，and future prospects.Applied and Environmental Microbiology，2005，71(9):4951-4959.

［16］ Velazhahan R，Samiyappan R.Relationship between antagonistic activities of Pseudomonas fluorescens islates against Rhizoctonia solani and their production of lyric enzymes.Journal of Plant Diseases and Protection，1999，106(3):244-250.

［17］ Lim H S，Kim Y S and Kim S D.Pseudomonas stutzeri YPL-1 genetic transformation and antifungal mechanism against Fusarium solanian agent of plant root rot.Applied and Environmental Microbiology，1991，57(2):510-516.

［18］ Yi L，Xiao C G，Ma G H，Wang W N，Long L K.Inhibition and screening of beneficial endophytic bacteria to control tobacco brown spot.Acta Microbiologica Sinica，2004，4(1):19-22.

［19］ Kamensky M，M Ovadis，Chet I，and Chernin L.Soil-borne strain IC14 of Serratia plymuthica with multiple mechanisms of antifungal activity provides biocontrol of Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum diseases.Soil Biology＆ Biochemistry，2003，35(2):323-331.

［20］ Singh P P，Shin Y C，Park C S，and Chung Y R.Biological control of Fusarium wilt of cucumber by chitinolytic bacteria.Phytopathology，1999，89(1):92-99.

［21］ Lai K P，Chen S H，Hu M Y，Hu Q B，Geng P，Weng Q F，Jia J W.Control of postharvest green mold of citrus fruit by application of endophytic Paenibacillus polymyxa strain SG-6.Postharvest Biology and Technology，2012，69(7):40-48.

［22］ Dinesh K Maheshwari.Plant growth and health promoting bacteria.Berlin:Springer Press，2010.

［23］ Gao L L，Chen X L，Jiang T，Jiang W N，Huang Q.Isolation and identification of endophytic nitrogen-fixing bacteria in rice with antipathogenic functions.Journal of Huazhong Agricultural University，2012，31(5):553-557.

參考文獻(xiàn):

［1］ 孫鋒，張寬朝.野生艾草黃酮的含量及抗氧化性研究.中國(guó)野生植物資源，2009，28(3):58-61.

［2］ 孫天竹，白日霞，海華.艾蒿色素的提取方法及其穩(wěn)定性研究.大連民族學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，6(5):43-45.

［3］ 顧小衛(wèi)，呂宗友，郭鵬，徐偉.江蘇野生艾葉揮發(fā)油成分的分析.北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，24(2):35-39.

［4］ 張玲春，李國(guó)清，劉澤文.艾蒿抽提物對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)卵的影響.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，25(4):110-112.

［5］ 劉桂霞，王靜，王謙謙，馬妍妍.艾蒿水浸提液對(duì)冰草和披堿草種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的化感作用.河北大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，32(1):81-86.

［6］ 徐亞軍，趙龍飛.野生艾蒿浸提物對(duì)大腸桿菌的抑制作用.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(4):306-308.

［7］ 趙龍飛.野生艾蒿浸提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用.食品工業(yè)，2011，32(6):7-8.

［8］ 石晶盈，陳維信，劉愛(ài)媛.植物內(nèi)生菌及其防治植物病害的研究進(jìn)展.生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26(7):2395-2401.

［9］ 劉金花，吳玲芳，章華偉.黃花蒿內(nèi)生菌的分離與初步鑒定.氨基酸和生物資源，2011，33(4):27-30.

［10］ 王輝，謝永生，楊亞利，揣峻峰.云霧山鐵桿蒿莖葉浸提液對(duì)封育草地四種優(yōu)勢(shì)植物的化感效應(yīng).生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，31(20):6013-6021.

［14］ 東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)和鑒定手冊(cè)(第一版).北京:科學(xué)出版社，2001.

［18］ 易龍，肖崇崗，馬冠華，王萬(wàn)能，龍良鯤.防治煙草赤星病有益內(nèi)生細(xì)菌的篩選及抑菌作用.微生物學(xué)報(bào)，2004，4(1):19-22.

［23］ 高玲玲，陳小龍，蔣濤，姜偉娜，黃瓊.具有拮抗作用的水稻內(nèi)生固氮菌的分離與鑒定.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，31(5):553-557.