基于ITS2和16S rRNA的西施舌群體遺傳差異分析

孟學(xué)平，申 欣，趙娜娜，2，田 美，曾 云，陳建安，董志國，程漢良，閻斌倫

(1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，連云港 222005;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇省海洋生物重點實驗室，南京 210095)

ITS2(The internal transcribed spacer 2)是真核生物5.8S和28S核糖體RNA(rRNA)基因間的DNA序列，此區(qū)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可為rRNA前體正確有效加工提供結(jié)構(gòu)元件和二級結(jié)構(gòu)。通常ITS2二級結(jié)構(gòu)5'端的2個結(jié)構(gòu)域非常保守，而3'端的結(jié)構(gòu)域變異較大。由于ITS2上述結(jié)構(gòu)特點，常被用于鑒別相關(guān)的種或推斷種內(nèi)和科間甚至更高分類水平的系統(tǒng)關(guān)系［1-3］。線粒體核糖體16S rRNA也適合解決雙殼類近緣種或類群的系統(tǒng)關(guān)系［4-6］。來自細(xì)胞核的ITS2和線粒體DNA的16S一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)相結(jié)合也被用來研究雙殼類同科不同種類的遺傳關(guān)系［1］或同屬不同種的系統(tǒng)發(fā)生分析［7］。西施舌(Coelomactra antiquata)是雙殼綱蛤蜊科(Mactridae)的一種海產(chǎn)名貴經(jīng)濟(jì)貝類，其肉質(zhì)細(xì)膩，營養(yǎng)豐富［8］，具有極高經(jīng)濟(jì)價值［9］。我國專家對西施舌群體形態(tài)［10-12］、生化［13-14］、分子遺傳差異及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進(jìn)行了卓有成效的研究工作，但目前西施舌群體遺傳背景尚不清晰，研究結(jié)果存在分歧:多數(shù)資料認(rèn)為福建(長樂、漳州)西施舌發(fā)生了明顯遺傳分化，可能是一個亞種或隱種［15-20］;少數(shù)資料認(rèn)為長樂西施舌與其它群體未達(dá)到種間差異的水平［14］;此外，一些研究認(rèn)為廣西北海西施舌與江蘇、山東、遼寧西施舌群體親緣關(guān)系近，與福建群體親緣關(guān)系遠(yuǎn)［15，17-18］，另一些研究結(jié)果認(rèn)為廣西西施舌與福建西施舌遺傳關(guān)系近［12］;要澄清上述分歧、確定福建西施舌是否是一個新種，需要更多的形態(tài)、生物和分子生物學(xué)資料佐證。本研究擬從核基因組DNA和線粒體基因組DNA兩個方面研究我國不同地理群體西施舌遺傳差異，從ITS2和16S一、二級結(jié)構(gòu)2個層次分析群體間差異，為我國西施舌群體遺傳關(guān)系和福建西施舌分類地位的確定提供更多分子生物學(xué)證據(jù)。對西施舌的增養(yǎng)殖學(xué)和野生資源保護(hù)和科學(xué)利用具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

本研究西施舌樣本分別來自遼寧大連(DL)(樣本數(shù)為4)、山東膠南(JN、JD)(2)、江蘇連云港(LYG)(32)、啟東(QD、XM)(34)，福建的長樂(CL)(35)，廣西北海(GX)(16)、越南(YN)(1)等海區(qū)，共124個;另一部分序列來源于GenBank中其他作者提交的序列，分別隸屬Q(mào)D(3)、GX(1)、CL(7，包括X1)、山東的日照(RZ)(2)、即墨(JM)(4)和JN(4)、平潭(X2)，LYG(X3)等海區(qū)，共計23個序列。樣本信息見表1、表2，因提交的序列為單倍型或基因型，GenBank中未反映出每個單倍型或基因型的樣本數(shù)，因此，本實驗把每個單倍型或基因型作為1個個體對待。本實驗所用實驗樣本在2005年12月到2011年12月采集。

表1 西施舌ITS2核苷酸序列信息Table 1 The information of ITS2 nucleotide sequences of Coelomactra antiquata

1.2 DNA提取、擴(kuò)增及序列測定

樣本總DNA按2010年Oliverio［21］的方法從閉殼肌或斧足肌肉中提取。純化的DNA定量測定后作為ITS2和16S序列PCR擴(kuò)增的模板。ITS2 PCR引物(primer，P)為ITS2-P1(5'GTTTCTTTTCCTCCGCTTACT3')和ITS2-P2(5'CACACTGAACATCGACAGCTT3')，擴(kuò)增產(chǎn)物450bp左右，包括5.8S和28S rRNA基因部分序列以及 ITS2全序列。16S部分序列 PCR引物為 16S3L(5'TGAGCGTGCTAAGGTAG3')和 16S4H(5'AGCCAACATCGAGGTCGC3')。擴(kuò)增產(chǎn)物為 350 bp。在 25 μL 反應(yīng)體系中，ddH2O 17.3 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，10×buffer 2.5 μL，Mg2+(10 mmol/L)2.5 μL，引物(25 μmol/L)各 0.5 μL，模板(20—50 ng)1 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL。反應(yīng)程序為 94 ℃ 預(yù)變性 3 min，然后 35 個循環(huán):94 ℃ 變性 30'，52 ℃ 退火30'，72℃延伸50'，最后72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)在Bio-Rad C1000 PCR儀上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用ABIPRISM3730測序儀雙向測序。

1.3 序列比對分析

DNA序列用DNAStar軟件組裝，結(jié)合測序峰圖進(jìn)行序列人工校對，用 ClustalX［22］軟件排序取齊，通過DnaSP 5.0軟件統(tǒng)計各群體的單倍型或基因型，利用MEGA 4［23］分析序列特征、計算遺傳差異和遺傳距離，構(gòu)建NJ(Neighbor-joining)和 MP(Maximum parsimony)系統(tǒng)進(jìn)化樹;用The mfold Web Server(http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold)進(jìn)行DNA和RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

表2 西施舌16S rRNA基因片段信息Table 2 The information of 16S rRNA gene fragments of Coelomactra antiquata

2 結(jié)果

2.1 ITS2和16SrRNA基因序列信息

本研究西施舌樣本來源于我國南北沿海的9個海區(qū)及鄰近廣西北海的越南海域，共獲得147條DNA序列，其中ITS2序列74條，16S序列73條。本研究擴(kuò)增獲得西施舌ITS2序列68條，16S序列56條(表2);從GenBank下載的ITS2序列6條，16S序列17條。

用DnaSPv5分析ITS2獲得17種基因型(genotype，Gen)(Gen1-17)(表1)，每種基因型的出現(xiàn)頻率不同，其中Gen3出現(xiàn)頻率最高，為32.4%(24/74)，Gen2出現(xiàn)頻率次之，為23.0%，頻率為5%—7%的基因型有4種，其余11種基因型出現(xiàn)頻率分別為1.4%和4.1%。CL(包括YN群體)群體特有基因型有9種(Gen6—14)，不與其它群體共享。此外，GX、JM、JN和RZ群體各有1—2個群體特有基因型。Gen1—Gen3為非長樂群體交叉共享基因型，其中Gen3為GX、QD、LYG、DL 4個群體共享;Gen1為GX、QD、LYG 3個群體共享。廣西北海群體的ITS2基因型與北方群體基因型有交叉共享現(xiàn)象，與南方的長樂群體無共享。

16S序列共有15個單倍型(haplotype，Hap)(表2)，其中 Hap1、3、4、8、14 為 CL 群體特有單倍型，有4 種單倍型為2個以上群體交叉共享。如Hap2為膠南、即墨、連云港、啟東和X群體共享;Hap9為北海(GX)和日照群體共享。QD、JM 2個群體共享Hap11，JN、JM 2個群體共享Hap10。膠南、連云港、啟東、北海群體除具體有共享單倍型外，尚有1—2個群體特有的單倍型。Hap2和Hap1出現(xiàn)頻率較高，分別為34.2%和17.8%，其余單倍型出現(xiàn)頻率均低于8%。

2.2 ITS2和16S rRNA序列比對分析

本研究測得的西施舌ITS2全序列長度在389—401 bp之間，有核苷酸的插入/缺失現(xiàn)象。

對ITS2序列兩端取齊后獲得370—380 bp片段用于序列比對。ITS2序列分析顯示，17種基因型有23個變異位點(圖1A)，占比對位點的5.7%(23/401)，其中簡約信息位點16個，占4.0%(16/401)。CL群體9種基因型有6個共享變異位點，分別是第226位的堿基T，273—275位的TCT，317位的T和381位的G。而其它群體無共享變異位點。

根據(jù)ITS2 17種基因型核苷酸序列的變異，計算了不同群體間遺傳距離(考慮文章篇幅太大，不同基因型間的遺傳距離表格略)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CL群體與nCL群體間的遺傳距離在0.019—0.042之間，平均為0.029，群體內(nèi)的遺傳距離為0.005—0.022，平均為0.012，CL和 nCL群體間與群體內(nèi)遺傳距離之比為2.42(0.029/0.012)，而其余的DL、JM、JN、RZ、LYG、QD和GX群體間有交叉共享基因型，因此，將其列為一組，組內(nèi)遺傳距離為0.003—0.014，平均為0.007。由此可見，西施舌CL群體與nCL群體遺傳差異極為明顯。

本研究所測定的16S片段多數(shù)為306bp，GenBank下載的其他作者提交的序列有的多于360 bp，序列比對前將兩端多余序列去除取齊，獲得的比對序列長度均為306 bp。對15種16S單倍型序列比對發(fā)現(xiàn)，有35個變異位點(圖1B)，占比對位點的11.40%(35/306)，其中簡約信息位點24個，占7.84%。CL群體5個單倍型變異位點28個(9.15%)，其中有23(7.5%)個變異位點為5種單倍型共享。

圖1 西施舌ITS2(基因型)(A)和16S rRNA基因片段(單倍型)(B)變異位點Fig.1 The ITS2(genotype，Gen)(A)and 16S rRNA gene fragments(haplotype，Hap)(B)diversity sites of Coelomactra antiquata

基于16S序列所得各單倍型間的遺傳距離如表3，灰色背景里的數(shù)字為CL群體與nCL群體間的遺傳距離，在7.7%—9.5%之間，平均為8.1%。長樂群體內(nèi)個體間的遺傳距離在0.3%—1.0% 之間，平均為0.7%，群體間遺傳距離與群體內(nèi)遺傳距離之比為11.6。長樂以外的JM、JN、LYG、QD和GX 5個群體9種單倍型間的遺傳距離在0.3%—1.7%之間，平均為0.9%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于長樂群體與非長樂群體之間的遺傳距離。

表3 西施舌16S rRNA基因片段的遺傳距離Table 3 The genetic distances based on 16S rRNA gene fragments of Coelomactra antiquata

2.3 基于ITS2和16S核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ITS2和16S核苷酸序列，以與西施舌共屬一個科的中國蛤蜊(Mactra chinensis)和四角蛤蜊(Mactra veneriformis)作為外群，用鄰接法(NJ)和最大吝嗇法(MP)分析了西施舌9個群體親緣關(guān)系(圖2)，兩套DNA資料構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹均顯示CL群體(包括YN群體)均聚為支持率很高的單系支，在ITS2的NJ和MP樹中支持率分別為96和95;在16S的NJ(圖2，B)和MP(圖略)樹中，支持率分別為100和99，而其余的8個群體無一個群體聚為單系支，只是交叉聚為支持率很高的一支［16S:支持率為98/96(NJ/MP)］。因ITS2和16S資料之間不是對應(yīng)關(guān)系，因此，未將兩套資料排列在一起構(gòu)建進(jìn)化樹，盡管如此，但分別聚類結(jié)果也高度一致。

圖2 基于ITS2基因型(A)和16S rRNA基因單倍型(B)的西施舌不同群體N-J樹Fig.2 The N-J tree based on ITS2(genotypic，Gen)(A)and 16S rRNA gene fragments(haplotype，Hap)(B)of C.antiquata different stocks

2.4 ITS2和16S二級結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)ITS2和16S的序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。對基因型Gen3(DL、LYG、QD、GX群體共享)、Gen6(CL群體的一種基因型，命名為CL12-)和Gen10(CL群體的另一種基因型，命名為CL12+)3個有代表性的ITS2二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)分析(圖3)。結(jié)果顯示nCL群體ITS2二級結(jié)構(gòu)高度相似，幾乎無差異。CL群體與nCL群體ITS2二級結(jié)構(gòu)的a、b 2個結(jié)構(gòu)域相同，但位于a、b區(qū)之間的c、d、e三個區(qū)域有明顯的差異，c、d區(qū)是CL群體特有區(qū)域，而e區(qū)是nCL區(qū)域特有。根據(jù)c區(qū)的差異又可把CL群體的ITS2二級結(jié)構(gòu)分為CL12-(圖3B-c)和CL12+(圖3C-c)2種類型。CL12-型和CL12+型二級結(jié)構(gòu)極為相似，但結(jié)構(gòu)域c有差異，結(jié)構(gòu)域c的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖部結(jié)構(gòu)完全相同，但是環(huán)狀結(jié)構(gòu)差異很大，B-c中的環(huán)由ACTCGTT共7個堿基組成，而C-c比B-c環(huán)大，由19個堿基組成，在B-c中環(huán)的G與T之間插入一個12個核苷酸(CTTTACCGCTTG)序列;之外，圖3B-c和C-c莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3'側(cè)翼堿基組成也不同，B-c中3'側(cè)翼只有一個堿基T，而C-c中3'側(cè)翼為TCGC，比B-c多3個核苷酸(CGC)。上述結(jié)果證實ITS2基因型Gen3與Gen6、Gen10二級結(jié)構(gòu)形態(tài)明顯不同，極易區(qū)分。而CL群體與非長樂群體ITS2二級結(jié)構(gòu)a、b區(qū)相同，難以區(qū)別。長樂群體的CL12-和CL12+2種類型與生理或其它形態(tài)性狀有什么關(guān)系，深入研究。

圖3 西施舌ITS2二級結(jié)構(gòu)比較Fig.3 Comparation of the ITS2 secondary structure of Coelomactra antiquata

根據(jù)二級結(jié)構(gòu)形狀，可將16S片段15個單倍型分為2大類，第一類包括5種單倍型(Hap1，3，4，8，14)(圖4A)，這一類16S二級結(jié)構(gòu)的共同特點是主干莖環(huán)區(qū)較短，5種二級結(jié)構(gòu)中的DI和DII區(qū)均相同(圖4ADI，A-DII)，DIV 區(qū)在其中的2 種(Hap1，14)二級結(jié)構(gòu)中相同;第二類包括 10 種單倍型(Hap2，5-7，9-13，15)，其共同的二級結(jié)構(gòu)特點是主干莖環(huán)區(qū)較長(圖4B)，有2個區(qū)域(B-DI，B-DII)在10種單倍型中相同，且這兩個區(qū)域堿基所占比例較大。有趣的是第一類16S二級結(jié)構(gòu)中包含的單倍型均為CL群體所有，第二類二級結(jié)構(gòu)中全部為nCL群體所有。A-DI、A-DII為第一類二級結(jié)構(gòu)特有結(jié)構(gòu)域，B-DI、B-DII(多數(shù))是第二類二級結(jié)構(gòu)所特有，通過這四個結(jié)構(gòu)域極易將西施舌CL群體和nCL群體區(qū)別開來。

3 討論

3.1 ITS2和16S資料支持福建西施舌是腔蛤蜊屬的一個新種

一直以來，中國南北沿海西施舌被認(rèn)為是一個種，無人置疑過。近年來，一部分分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)的資料認(rèn)為福建群體與其它群體間的差異達(dá)到了種間差異水平，福建漳州或長樂西施舌是西施舌的一個亞種或隱種。但是要確定長樂西施舌的分類地位，僅現(xiàn)有的資料還不夠充分，還需更多的生物學(xué)和分子生物學(xué)資料的支持。本研究用核DNA(ITS2)和線粒體DNA(16S)序列資料對我國南北沿海9個群體西施舌遺傳差異分析結(jié)果顯示，基于16S核苷酸序列的CL群體與nCL群體間遺傳距離平均為8.1%，而nCL群體間的遺傳距離平均為0.7%。與西施舌同屬簾蛤目(Veneroida)的文蛤?qū)俚奈母騇eretrix meretrix(GQ463598)、麗文蛤Meretrix lusoria(GQ903339)和中華文蛤Meretrix petechialis(EU145977)3種貝類間(基于16S)遺傳距離為0.5%—6.7%;貽貝目貽貝屬(Mytilus)的紫貽貝Mytilus galloprovincialis(AY363687)，貽貝Mytilus edulis(AY823623)和油黑殼菜蛤Mytilus trossulus(DQ198225)3種貝類(基于16S)的遺傳距離為0.2%—0.7%。均小于西施舌CL群體與nCL群體間的遺傳距離，這些資料從側(cè)面證實CL群體與nCL群體的差異達(dá)到了種間差異水平。ITS2、16S二級結(jié)果顯示CL群體內(nèi)不同基因(單倍)型結(jié)構(gòu)相似，nCL群體內(nèi)各群體間二級結(jié)構(gòu)相似(圖3，圖4)，但CL、nCL群體間的二級結(jié)構(gòu)明顯不同。ITS2和16S二級結(jié)構(gòu)比較結(jié)果提示中國西施舌存在新種，即福建西施舌可能是腔蛤蜊屬的一個新種。這個結(jié)果與 ITS1［15］、COX1［18］、cytb［17］、AFLP［19］、形態(tài)學(xué)分析［10，11］結(jié)果一致。

圖4 西施舌16S rRNA基因單倍型二級結(jié)構(gòu)比較Fig.4 Comparation of the16S rRNA gene hyplotype secondary structure of Coelomactra antiquata

Hebert等［24］基于細(xì)胞色素C氧化酶亞基3(cox3)核苷酸序列，計算了軟體動物的1155個同屬內(nèi)物種對的遺傳距離，平均為11.1%。此外，Hebert等［25］提出群體間差異若為群體內(nèi)個體間差異的10倍，則認(rèn)為這種差異達(dá)到種的水平，即“10×”規(guī)則。日照西施舌與漳州(同長樂西施舌的差異屬種內(nèi)差異)［18］西施舌cox1全序列核苷酸差異(divergence)為14.5%，大于軟體動物同屬不同種間的差異水平，也達(dá)到“10×”規(guī)則的水平。Ni等［26］對蛤蜊科11種貝類cox1和16S序列差異分析顯示，cox1的種內(nèi)遺傳距離低于2.5%，而屬內(nèi)種間遺傳距離為8.2%—28.4%，是種內(nèi)遺傳距離的3.2—11.4倍，最小種間(M.coralline和 M.lignaria)遺傳距離為8.5%—9.3%。由此可見，CL和nCL群體西施舌遺傳差異也達(dá)到蛤蜊科同屬不同種間差異水平;11種貝類16S的種內(nèi)和種間遺傳距離分別為0—0.9%，1.4%—27.1%，種間遺傳距離是種內(nèi)的1.6—30.1倍。本研究結(jié)果顯示西施舌16S的CL與nCL群體間遺傳距離為8.1%，是CL群體內(nèi)(0.7%)的11.6倍，此差異水平在蛤蜊科11種貝類種間差異水平范圍內(nèi)。孟學(xué)平比較漳州與日照西施舌線粒體全基因組顯示，兩者的主非編碼區(qū)(MNR)所在位置雖然相同，但大小和序列存在明顯差異，前者無串聯(lián)重復(fù)序列，而后者有11個拷貝的99個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，且兩者的MNRs無可比性［27］。Xu等［28］對巴非蛤?qū)?Paphia)4種不同貝類線粒體全基因組比較研究顯示，Paphia undulata和P.textile的MNR所在位置相同，均有串聯(lián)重復(fù)區(qū)，只是串聯(lián)重復(fù)單位大小和的拷貝數(shù)不同。同種不同個體mtDNA MNR若存在串聯(lián)重復(fù)區(qū)，其拷貝數(shù)可能有變化(異質(zhì)性)，但同種不同個體MNR的有和無的現(xiàn)象目前在雙殼類中尚未發(fā)現(xiàn)。因此，mtDNA MNR的差異也強(qiáng)有力地支持漳州西施舌與日照西施舌的差異達(dá)到種的水平，這與本研究的結(jié)果一致。

3.2 西施舌廣西北海群體與遼寧、山東和江蘇群體差異用ITS2、16S標(biāo)記不易區(qū)分

廣西北海大陸海岸線離北方沿海(如江蘇啟東)最近也有7000多公里，本研究ITS2和16S資料證實西施舌北海群體(GX)與北方群體(JM、JN、RZ、LYG、QD和DL)親緣關(guān)系近，基于16S和ITS2的遺傳距離分別為0.005—0.010 和0.005—0.016，與福建群體遺傳關(guān)系遠(yuǎn)(遺傳距離 16S/ITS2:0.080—0.088/0.022—0.036)。此外，廣西群體16S和ITS2均有與北方群體共享單倍型或基因型，與CL群體無共享單倍型或基因型。這充分說明廣西群體與北方群體的遺傳關(guān)系近，與福建群體遺傳關(guān)系遠(yuǎn)。cox1［18］、cob［17］、ITS1［15］資料也與本研究結(jié)果一致。這種現(xiàn)象與地理距離與遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近的一般規(guī)律不相符。此種現(xiàn)象在巴非蛤［29］和青蛤［30］不同群體中也存在。造成這種現(xiàn)象的原因之一可能是人為因素造成。尤仲杰對山東膠南、江蘇南通、浙江臺州、福建福州、廣西北海5個群體的RAPD分析證實廣西北海西施舌分化最大，可能形成了一個地理種群，而福州西施舌未形成地理種群［12］;等位酶的研究也認(rèn)為北海西施舌形成了地理種群［14］。本研究結(jié)果與RAPD［12］、等位酶的研究結(jié)果有分歧。因此，關(guān)于廣西西施舌與其它群體的遺傳關(guān)系需要用更有說服力的生物及分子生物學(xué)資料作深入研究。

致謝:感謝東華大學(xué)孟清教授、意大利博洛尼亞大學(xué)Plazzi博士和美國北卡羅來納州立大學(xué)Raley博士對本文英文摘要的修改潤色。

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