松果梢斑螟對蟲害誘導(dǎo)寄主防御的抑制作用

張 曉，李秀玲，李新崗，楊立軍，陳 輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院/國家林業(yè)局黃土高原重點實驗室，楊凌 712100)

松果梢斑螟(Dioryctria pryeri Ragonot)和油松球果小卷蛾(Gravitarmata margarotana(Heinemann))是我國松屬針葉樹重要的球果和枝梢害蟲，一年一代，以幼蟲鉆蛀危害，長期以來對我國針葉樹的正常生長、自然更新和種子生產(chǎn)造成很大影響［1］。特別是北方油松(Pinus tabuleaformis Mill.)良種基地，受害更為嚴(yán)重［2-3］。由于球果小卷蛾對油松球果的先期危害，引誘松果梢斑螟趨向蟲害球果產(chǎn)卵和取食，即誘導(dǎo)負(fù)防御［3-5］或誘導(dǎo)敏感性［6］。小卷蛾幼蟲危害時間比梢斑螟幼蟲早7—10 d，并且小卷蛾幼蟲的先期危害誘導(dǎo)了油松球果的直接防御和間接防御［2-4］;如顯著增加了蛋白酶抑制劑(PIs)、多酚氧化酶(PPO)和松脂含量，特別是雙萜松脂酸［2-3］。梢斑螟幼蟲在油松上，發(fā)育快、個體較大、活躍、競爭能力強，可在蟲害球果中正常發(fā)育［1］。但高含量松脂(松脂酸)球果(如華山松球果)嚴(yán)重影響梢斑螟幼蟲的生長與存活，松脂酸也成為梢斑螟幼蟲的直接防御物質(zhì)［1，3，5］。

近年來，關(guān)于蟲害誘導(dǎo)負(fù)防御的研究已經(jīng)很多，主要是引誘成蟲產(chǎn)卵或幼蟲取食的報道，并集中在蟲害誘導(dǎo)揮發(fā)物的引誘方面［6-9］。蟲害誘導(dǎo)負(fù)防御是植物誘導(dǎo)防御的一種形式［5-6］，不但松果梢斑螟趨向蟲害球果，梢斑螟屬(Dioryctria)和其它類群的昆蟲也都有趨向蟲害寄主或組織的習(xí)性［6-8］。但趨向蟲害寄主取食的害蟲，如何克服或適應(yīng)蟲害的誘導(dǎo)防御，可能涉及一些科學(xué)問題，如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物被更嚴(yán)重的害蟲適應(yīng)或克服、誘抗劑應(yīng)用后引起潛在害蟲的嚴(yán)重危害等。Karban和Baldwin認(rèn)為，蟲害寄主(誘導(dǎo)揮發(fā)物)暗示著競爭者和天敵的存在、植物營養(yǎng)質(zhì)量的下降，也代表著潛在寄主的存在［6］。

害蟲取食危害與其激發(fā)子一起，激活植物防御基因，使植物產(chǎn)生誘導(dǎo)防御物質(zhì)對付昆蟲。但葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOX)是多食性或具強競爭性鱗翅目幼蟲下唇腺中抑制植物誘導(dǎo)防御的“激發(fā)子”，可抑制植物的防御，提高害蟲自身的適應(yīng)性［6，10-18］。采用分光光度計法可測定昆蟲下唇腺GOX活性［18-20］，且同一昆蟲不同寄主組織或不同質(zhì)量的飼料對昆蟲GOX活性影響很大［14，18-19］。據(jù)生長率理論，昆蟲的生長率和蟲體RNA含量與P含量高度耦合［21］，測定同一齡期不同組織梢斑螟幼蟲RNA和P含量［21-22］，就可反映取食組織對梢斑螟幼蟲生長發(fā)育的影響。為了進一步探討小卷蛾危害引起油松球果的負(fù)防御機制，以及梢斑螟幼蟲對寄主防御的適應(yīng)和抑制作用［3］，本文研究了不同組織梢斑螟幼蟲GOX活性和蟲害組織中的萜類防御物質(zhì)變化，以及不同組織中梢斑螟幼蟲的RNA和P含量。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 材料來源

油松球果和新梢采自甘肅省正寧縣中灣油松良種基地，位于子午嶺西部，海拔1300—1500 m，1983—1985 年營建，樹齡30a，樹高約6 m，405 株/hm2，郁閉度0.5—0.6，坡度10—20°。采樣時間為2009 和2010 年5月，正是松果梢斑螟幼蟲的危害期，通過田間接蟲標(biāo)記，并選擇蟲害第1天、第5天、第10天和第15天(分別為3、4、5齡和老熟幼蟲)的球果和新梢，以健康球果和新梢為對照，每個處理3個重復(fù)。球果的取樣部位為2年生球果的鱗片，分別從蛀孔左側(cè)、右側(cè)及后方取樣;新梢的取樣部位為當(dāng)年生新梢頂部，約2 cm，三分法取樣。球果、新稍取樣均為 0.3g，置于-80℃用于防御物質(zhì)的分析［3，23］。

1.1.2 供試?yán)ハx

松果梢斑螟幼蟲采樣地點和時間同上。采集正在取食球果和新梢的梢斑螟幼蟲，每兩天采樣1次。按取食部位，將其分為危害球果的1果1蟲、1果多蟲、與小卷蛾共生和危害新梢4個處理。每個處理分別取3齡、4齡和5齡取食活躍期和脫皮期幼蟲，以及老熟幼蟲各30—60頭，共3份材料，置于-80℃分別用于測試幼蟲下唇腺GOX活性、RNA和P含量。

1.2 梢斑螟幼蟲葡萄糖氧化酶活性測定

1.2.1 幼蟲下唇腺提取液的制備

分別解剖1果1蟲、1果多蟲、與小卷蛾共生和危害新梢4個處理的梢斑螟幼蟲，取出下唇腺，在pH 7.0的磷酸緩沖液(0.05 mol/L)中冰浴研磨，4℃ 12000×g離心15 min，取上清液為下唇腺提取液。3齡幼蟲每樣品中有10頭幼蟲的下唇腺，其他齡期每樣品中有5頭幼蟲下唇腺，重復(fù)6次［13，19］。

1.2.2 下唇腺葡萄糖氧化酶活性測定

GOX活性測定參照Bergmeyer等方法［24］，用UV-1240(uv mini)分光光度計測定。35℃條件下，反應(yīng)混合物包括:0.17 mmol/L 鄰聯(lián)茴香胺(Sigma)，1.72%D-葡萄糖緩沖溶液(pH 7.0)2.9 mL，60 U/mL 辣根過氧化物酶(Roche)溶液和下唇腺提取液各0.1mL。用0.1 mL緩沖液代替下唇腺提取液為對照。在500 nm下連續(xù)記錄5 min反應(yīng)混合物的光吸收，計算每分鐘的光吸收變化并作圖，取線性變化范圍內(nèi)每分鐘變化值。蛋白質(zhì)濃度測定以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用考馬斯亮藍染色法測定［19，25］。

式中，△A表示線性變化范圍內(nèi)每分鐘變化值;N表示酶液總體積;W表示蛋白質(zhì)含量(mg/mL);T表示光反應(yīng)時間(min);V表示加入的酶液體積。Ao表示鄰聯(lián)茴香胺在500 nm下的摩爾消光系數(shù)，為7.5。

1.3 寄主萜類化合物的提取與分析

1.3.1 萜類成分的提取

根據(jù)Miller等的叔丁基甲基醚(TBME)浸提并甲酯化法(簡稱甲酯化法)，選取0.3g球果或新梢樣品，加入1.5 mL叔丁基甲基醚(加150 μg/mL異丁基苯為內(nèi)標(biāo))，震蕩浸提14 h，過濾，用0.3 mL 0.1 mol/L的(NH4)2CO3(pH8.0)洗脫，取0.4 mL洗脫后的醚提取物，加0.16 mL甲醇和0.15 mL三甲基硅基重氮甲烷、密封，在室溫下放置30 min，再加入0.6 mL洗脫提取物，用裝有0.3g硅膠和0.2g無水硫酸鎂的巴斯德滴管過濾，用1 mL乙醚洗脫硅膠柱，所得樣品置于-20℃冰箱中待分析［23］。

1.3.2 GC-MS 分析

萜類分析利用美國Thermo-Finnigan公司的TraceDSQ氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS)，色譜柱利用DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm ID，膜厚0.25 μm)，載氣氫氣;流速 2 mL/min，F(xiàn)ID 溫度300℃，進樣口溫度 220℃，進樣1μL，分流比10∶1。起始溫度40℃，停留3 min，以3℃/min速率升溫至110℃，然后以10℃/min速率升溫至180℃，再以15℃/min速率升溫至250℃，保留10 min。質(zhì)譜條件:EI離子源，電離能70ev。各成分通過與譜庫(NISTZOOZ版)標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)譜圖核對并分析后，進行定性，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法進行定量［2-4，23］。

1.4 梢斑螟幼蟲RNA和P含量測定

1.4.1 RNA 提取和含量測定

采用顯微熒光測定法測試RNA含量。取3齡、4齡和5齡取食活躍期幼蟲各30頭(見1.1.2蟲源)，每組蟲體的RNA用Trizol Reagent(Invitrogen)提取。RNA含量測定以酵母RNA為標(biāo)準(zhǔn)，采用對RNA有高度特異性的熒光試劑Ribo-Green測定。具體方法(Ribo Green RNA quantitation reagent and Minicell Adaptor Kit(P/N 3800-928))為:將RNA樣品用TE稀釋后取1 mL與等體積1∶2000稀釋的RiboGreen試劑混勻，黑暗中放置5 min后在激發(fā)和發(fā)射波長分別為500 nm和525 nm條件下測定并記錄。所有RNA的含量均為占蟲體干重的百分比［21］。

1.4.2 P 含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取磷酸二氫鉀0.4407g配置標(biāo)準(zhǔn)品溶液(每1mL含磷10.05μg)。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2 和 1.5 mL 分別置試管中，各加水至 3 mL，搖勻;再分別加入定磷試劑(2.5% 鉬酸銨溶液∶3 mol/L 硫酸溶液∶水∶10%抗壞血酸=1∶1∶2∶1，用前配制)3 mL，搖勻;在 50℃水浴中反應(yīng) 25 min。以0 號管作為空白對照，用UV-1240(uv mini)分光光度計在650 nm測定各樣品液的吸光度。以溶液吸光度對其濃度作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

P含量的測定:采用抗壞血酸-鉬藍顯色定磷法測定蟲體中總P含量。取3齡、4齡和5齡取食活躍期幼蟲各30頭，將蟲體在50℃烘48 h后經(jīng)濃硫酸、濃硝酸硝化。樣品溶液與定磷試劑混合搖勻，測定樣品溶液的吸光度。利用磷標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總磷含量，樣品P含量為其占蟲體干重的百分比［21-22］。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)用SPSS 10.0單因素方差(ANOVA)分析樣品間的差異顯著性，用a、b表示差異顯著(P＜0.05);用A、B表示差異極顯著(P＜0.01)。采用Sigmaplot 10.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 松果梢斑螟下唇腺葡萄糖氧化酶活性變化

圖1為不同組織中松果梢斑螟幼蟲下唇腺GOX活性?？梢钥闯觯紫x發(fā)育期內(nèi)GOX活性呈動態(tài)變化，1果1蟲、1果多蟲、與小卷蛾共生和新梢4個處理梢斑螟幼蟲GOX活性隨蟲齡而增加，有相同的變化趨勢。但在幼蟲脫皮期(每齡第4天)酶活性較低，取食活躍期(每齡第2天)酶活性顯著增加。3齡、4齡和5齡取食活躍期GOX活性依次極顯著升高(P＜0.001)，在5齡取食活躍期GOX活性最高，老熟幼蟲GOX活性最低。

新梢、1果1蟲、1果多蟲、與小卷蛾共生等不同部位，其同一齡期梢斑螟幼蟲GOX活性不同。3齡幼蟲中，與小卷蛾共生的幼蟲酶活性 ＞1果1蟲和1果多蟲的幼蟲酶活性 ＞取食新梢的幼蟲酶活性，但差異不顯著。4齡幼蟲中，與小卷蛾共生的幼蟲酶活性最高(0.62±0.04)，取食新梢的幼蟲酶活性最低(0.42±0.08)，取食球果(1果1蟲和1果多蟲)居中，三者差異顯著。但1果多蟲(0.50±0.02)和1果1蟲(0.55±0.05)的幼蟲酶活性差異不顯著。5齡幼蟲中，與小卷蛾共生的幼蟲酶活性最高(0.81±0.07)，顯著高于新梢(0.57±0.05)，其余之間差異不顯著。

2.2 蟲害球果和新梢萜類含量的變化

圖2為蟲害油松球果和新梢單萜、倍半萜和雙萜含量變化?？梢钥闯?，單萜、倍半萜和雙萜含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，球果的萜類含量隨蟲害時間延長而明顯下降。蟲害1 d時，新梢和球果單萜總含量均顯著增加(P＜0.01)，隨蟲害時間而逐漸降低，蟲害15 d時，單萜含量最低。作為新梢和球果單萜主要成分的1R-α-蒎烯和D-檸檬烯含量與單萜總含量有一致的變化趨勢，即蟲害后先升后降，最后與對照水平接近(圖1，表1，表2)。

表1 蟲害油松球果主要單萜成分含量隨時間的變化/(mg/g鮮重)Table 1 Changes of major monoterpene content with time in the infested cones

圖1 不同組織中梢斑螟幼蟲下唇腺葡萄糖氧化酶活性比較Fig.1 Glucose oxidase(GOX)activity in labial salivary glands of D.pryeri developed in four host tissues

油松球果和新梢中倍半萜含量較少，蟲害后倍半萜含量明顯下降。蟲害初期，球果中倍半萜含量沒有變化，隨后顯著下降;而新梢蟲害初期倍半萜含量略有增加，隨后明顯下降。倍半萜總含量，球果略高于新梢(圖1)。球果和新梢中主要倍半萜均為石竹烯、α-石竹烯和1-甲基-5-亞甲基-8-(1-異丙基)-1，6-環(huán)十二烯，其中石竹烯含量較大。在蟲害球果，初期(第1天)石竹烯增加，隨后顯著下降;而其它2種成分蟲害后顯著降低(表3)。蟲害后，新梢中的石竹烯顯著增加，隨后呈曲線波動;α-石竹烯蟲害后顯著增加，隨后降低;1-甲基-5-亞甲基-8-(1-異丙基)-1，6-環(huán)十二烯在蟲害初期含量變化不大，但在蟲害10 d后，該成分檢測不到(表4)。

表2 蟲害新梢主要單萜成分隨時間的變化/(mg/g鮮重)Table 2 Changes of major monoterpene content with time in the infested branches

圖2 松果梢斑螟幼蟲危害后油松球果及新梢萜類含量隨時間的變化Fig.2 Changes of terpene content with time in fested cones and branches

表3 蟲害球果主要倍半萜成分隨時間的變化/(mg/g鮮重)Table 3 Changes of major sesquiterpene content with time in the infested cones

圖2可以看出，球果蟲害后，雙萜含量顯著增加，后期明顯降低到正常水平。蟲害第1天雙萜含量達到最大(7.993 mg/g鮮重)，是健康球果的1.7倍;蟲害5 d時雙萜含量是健康球果的1.4倍，第10天雙萜含量開始下降，第15天時接近健康球果水平。新梢蟲害后，其雙萜含量初期顯著增加，隨后逐漸接近健康新梢，但蟲害第15天時雙萜含量又顯著高于健康新梢(圖1)。蟲害球果和新梢顯著增加雙萜成分是松香酸甲酯、1-菲羧酸甲酯類和貝殼杉-16-烯-18-酸酯，新梢中松香酸甲酯含量較少。雙萜主要成分的變化趨勢與總含量一致:蟲害后顯著增加，后逐漸降低(表5，表6)。

表4 蟲害新梢主要倍半萜成分隨時間的變化/(mg/g鮮重)Table 4 Changes of major sesquiterpene content with time in the infested branches

表5 蟲害球果主要雙萜成分隨時間的變化/(mg/g鮮重)Table 5 Changes of major diterpene content with time in the infested cones

表6 蟲害誘導(dǎo)新梢主要雙萜成分隨時間的變化/(mg/g鮮重)Table 6 Changes of major diterpene content with time in the infested branches

2.3 取食寄主不同部位對梢斑螟幼蟲RNA和P含量的影響

根據(jù)生長率和蟲體RNA與P含量高度耦合的理論［21］，測定取食不同處理食物的梢斑螟幼蟲RNA與P含量，可間接反映寄主食料對幼蟲生長發(fā)育的影響。表7可以看出，取食3種不同處理寄主食物的梢斑螟幼蟲，都以3齡幼蟲的RNA含量和P含量最高，其次是4齡幼蟲和5齡幼蟲，差異極顯著(P＜0.01)。說明梢斑螟3齡幼蟲的生長率較快，之后逐漸變緩。

就取食部位來看，3個齡期幼蟲RNA含量均為:取食新梢幼蟲 ＜取食小卷蛾危害球果幼蟲＜取食球果(1果1蟲和1果多蟲)幼蟲，但無顯著差異。就P含量來看，除4齡幼蟲外，取食球果的梢斑螟幼蟲P含量較高，取食新梢的幼蟲P含量較低，差異不顯著。說明3種處理食物對梢斑螟幼蟲生長率影響無顯著差異。

表7 取食寄主不同部位梢斑螟幼蟲RNA和P含量比較Table 7 RNA and P content comparison of pine comeworm larvae in different host tissue

3 討論

在北方油松良種基地，每年7月，羽化的松果梢斑螟成蟲趨向蟲害(干枯的)球果附近產(chǎn)卵;翌年5月，小卷蛾幼蟲先期危害，引誘梢斑螟越冬幼蟲趨向正在發(fā)育的蟲害球果;同時，梢斑螟幼蟲也危害健康球果和新梢［1-2，4］。在林區(qū)條件下，本研究選擇梢斑螟與小卷蛾一起危害(與小卷蛾共生)的球果、有1頭梢斑螟幼蟲(1果1蟲)的球果、有2—3頭梢斑螟幼蟲(1果多蟲)的球果和梢斑螟危害新梢等4種處理，取食不同食料的梢斑螟幼蟲下唇腺GOX活性測試表明，4種食料均以5齡幼蟲GOX活性最高，顯著高于4齡和3齡幼蟲。并且，3個齡期的幼蟲均表現(xiàn)為:球果中與小卷蛾共生的梢斑螟幼蟲GOX活性 ＞球果中單一梢斑螟幼蟲酶活性＞新梢中幼蟲酶活性，其中與小卷蛾共生的4齡和5齡幼蟲GOX活性顯著高于新梢內(nèi)的幼蟲。研究發(fā)現(xiàn)，多食性鱗翅目幼蟲下唇腺GOX可顯著抑制植物的防御。并且，人工飼料飼養(yǎng)的幼蟲GOX活性顯著高于寄主植物上發(fā)育的幼蟲，同一昆蟲不同寄主上幼蟲GOX活性也顯著不同，反映了食料質(zhì)量(碳水化合物、蛋白等)影響幼蟲GOX活性水平［14，18-19］，這與本研究結(jié)果一致。

雙萜(松脂酸)是針葉樹組成和誘導(dǎo)防御的主要物質(zhì)，可作為植食性昆蟲的有毒成分而起到直接防御作用［26-28］。松脂萜類聚集在針葉樹特化的松脂道中，蟲害引起松脂道受損，伴有單萜揮發(fā)物的松脂在受害部位形成物理和化學(xué)障礙。而倍半萜在松脂中所占比例較?。?，28］。本研究結(jié)果顯示，雙萜(松脂酸)的基礎(chǔ)量最大(5.0 mg/g 鮮重左右)，而倍半萜則很少(0.3—0.5 mg/g 鮮重)，單萜在1.5 mg/g 鮮重左右;蟲害后，松脂酸變化在±2.5 mg/g鮮重，蟲害球果隨時間逐漸減少，第10天后低于2.7 mg/g鮮重;而新梢蟲害后，松脂酸初期顯著增加，隨后降低，最后顯著高于健康梢。蟲害后，單萜的情況類似雙萜，而倍半萜在蟲害球果和新梢中，總體是逐漸減少的。與球果比較，新梢的防御物質(zhì)(松脂酸)逐漸增加。以前研究中，比較了油松球果小卷蛾幼蟲危害后，蟲害球果萜類的變化，以及其它防御物質(zhì)的增加［2-3］，在本研究中沒有比較2種害蟲危害油松球果防御反應(yīng)的差異。

與小卷蛾共生、油松球果和新梢3種食料的梢斑螟幼蟲RNA和P含量顯示，3齡幼蟲RNA和P含量最高，隨后逐漸減少，差異極顯著，說明前期幼蟲發(fā)育快，后期幼蟲發(fā)育慢，符合生長率與蟲體RNA和P含量高度耦合的生長率理論［21］。在3種食料中，3個齡期幼蟲RNA和P含量與食料密切相關(guān)，但3種食料間幼蟲RNA和P含量(即生長率)無顯著差異，說明梢斑螟幼蟲可通過GOX調(diào)節(jié)和抑制植物的防御［10-15，18-20］。但3種食料對梢斑螟存活、蛹重和生殖的影響還不清楚［19］。下唇腺GOX的高抑制作用是多食性鱗翅目幼蟲應(yīng)對寄主誘導(dǎo)防御的對策［18］，而GOX及其產(chǎn)物H2O2通過激發(fā)水楊酸(SA)途徑而抑制茉莉酸-乙烯(JA-ET)調(diào)控的植物防御，改變了植物基因表達，所以GOX能抑制寄主的直接和間接防御［12，20］。小卷蛾幼蟲的先期危害，激發(fā)了JA途徑調(diào)控的誘導(dǎo)防御，降低了食物質(zhì)量［3，5］，但后來的梢斑螟幼蟲用GOX抑制松脂酸等防御物質(zhì)［20］，使其生長率與健康球果、新梢中的幼蟲基本一致。

油松球果小卷蛾幼蟲的先期危害，引誘梢斑螟越冬幼蟲趨向球果取食［2］，造成2種害蟲對食料的競爭。在競爭中，小卷蛾幼蟲處于劣勢而部分死亡，梢斑螟幼蟲的死亡率卻很低［1］。但是，由于小卷蛾幼蟲提前脫果下地，通過蟲害球果揮發(fā)物(間接防御)而引誘寄生蜂，使受害球果內(nèi)的梢斑螟幼蟲寄生率提高，說明趨向受害球果的梢斑螟幼蟲，面臨著天敵的威脅［1-2，6］。球果受害后，抗?fàn)I養(yǎng)、抗消化酶類和防御物質(zhì)增加，營養(yǎng)質(zhì)量下降［2-3］，但本研究表明，梢斑螟幼蟲通過GOX活性抑制植物的防御，使不同食料的幼蟲生長率基本一致。后來羽化的梢斑螟成蟲，通過蟲害揮發(fā)物，趨向蟲害球果附近產(chǎn)卵［4］。進一步證明，蟲害寄主(誘導(dǎo)揮發(fā)物)暗示著競爭者和天敵的存在，寄主營養(yǎng)質(zhì)量的下降，也代表著潛在寄主的存在［6］，說明后來者具有特殊的克服機制。

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