張 曉,李秀玲,李新崗,楊立軍,陳 輝
(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院/國家林業(yè)局黃土高原重點實驗室,楊凌 712100)
松果梢斑螟(Dioryctria pryeri Ragonot)和油松球果小卷蛾(Gravitarmata margarotana(Heinemann))是我國松屬針葉樹重要的球果和枝梢害蟲,一年一代,以幼蟲鉆蛀危害,長期以來對我國針葉樹的正常生長、自然更新和種子生產(chǎn)造成很大影響[1]。特別是北方油松(Pinus tabuleaformis Mill.)良種基地,受害更為嚴(yán)重[2-3]。由于球果小卷蛾對油松球果的先期危害,引誘松果梢斑螟趨向蟲害球果產(chǎn)卵和取食,即誘導(dǎo)負(fù)防御[3-5]或誘導(dǎo)敏感性[6]。小卷蛾幼蟲危害時間比梢斑螟幼蟲早7—10 d,并且小卷蛾幼蟲的先期危害誘導(dǎo)了油松球果的直接防御和間接防御[2-4];如顯著增加了蛋白酶抑制劑(PIs)、多酚氧化酶(PPO)和松脂含量,特別是雙萜松脂酸[2-3]。梢斑螟幼蟲在油松上,發(fā)育快、個體較大、活躍、競爭能力強,可在蟲害球果中正常發(fā)育[1]。但高含量松脂(松脂酸)球果(如華山松球果)嚴(yán)重影響梢斑螟幼蟲的生長與存活,松脂酸也成為梢斑螟幼蟲的直接防御物質(zhì)[1,3,5]。
近年來,關(guān)于蟲害誘導(dǎo)負(fù)防御的研究已經(jīng)很多,主要是引誘成蟲產(chǎn)卵或幼蟲取食的報道,并集中在蟲害誘導(dǎo)揮發(fā)物的引誘方面[6-9]。蟲害誘導(dǎo)負(fù)防御是植物誘導(dǎo)防御的一種形式[5-6],不但松果梢斑螟趨向蟲害球果,梢斑螟屬(Dioryctria)和其它類群的昆蟲也都有趨向蟲害寄主或組織的習(xí)性[6-8]。但趨向蟲害寄主取食的害蟲,如何克服或適應(yīng)蟲害的誘導(dǎo)防御,可能涉及一些科學(xué)問題,如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物被更嚴(yán)重的害蟲適應(yīng)或克服、誘抗劑應(yīng)用后引起潛在害蟲的嚴(yán)重危害等。Karban和Baldwin認(rèn)為,蟲害寄主(誘導(dǎo)揮發(fā)物)暗示著競爭者和天敵的存在、植物營養(yǎng)質(zhì)量的下降,也代表著潛在寄主的存在[6]。
害蟲取食危害與其激發(fā)子一起,激活植物防御基因,使植物產(chǎn)生誘導(dǎo)防御物質(zhì)對付昆蟲。但葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOX)是多食性或具強競爭性鱗翅目幼蟲下唇腺中抑制植物誘導(dǎo)防御的“激發(fā)子”,可抑制植物的防御,提高害蟲自身的適應(yīng)性[6,10-18]。采用分光光度計法可測定昆蟲下唇腺GOX活性[18-20],且同一昆蟲不同寄主組織或不同質(zhì)量的飼料對昆蟲GOX活性影響很大[14,18-19]。據(jù)生長率理論,昆蟲的生長率和蟲體RNA含量與P含量高度耦合[21],測定同一齡期不同組織梢斑螟幼蟲RNA和P含量[21-22],就可反映取食組織對梢斑螟幼蟲生長發(fā)育的影響。為了進一步探討小卷蛾危害引起油松球果的負(fù)防御機制,以及梢斑螟幼蟲對寄主防御的適應(yīng)和抑制作用[3],本文研究了不同組織梢斑螟幼蟲GOX活性和蟲害組織中的萜類防御物質(zhì)變化,以及不同組織中梢斑螟幼蟲的RNA和P含量。
1.1.1 材料來源
油松球果和新梢采自甘肅省正寧縣中灣油松良種基地,位于子午嶺西部,海拔1300—1500 m,1983—1985 年營建,樹齡30a,樹高約6 m,405 株/hm2,郁閉度0.5—0.6,坡度10—20°。采樣時間為2009 和2010 年5月,正是松果梢斑螟幼蟲的危害期,通過田間接蟲標(biāo)記,并選擇蟲害第1天、第5天、第10天和第15天(分別為3、4、5齡和老熟幼蟲)的球果和新梢,以健康球果和新梢為對照,每個處理3個重復(fù)。球果的取樣部位為2年生球果的鱗片,分別從蛀孔左側(cè)、右側(cè)及后方取樣;新梢的取樣部位為當(dāng)年生新梢頂部,約2 cm,三分法取樣。球果、新稍取樣均為 0.3g,置于-80℃用于防御物質(zhì)的分析[3,23]。
1.1.2 供試?yán)ハx
松果梢斑螟幼蟲采樣地點和時間同上。采集正在取食球果和新梢的梢斑螟幼蟲,每兩天采樣1次。按取食部位,將其分為危害球果的1果1蟲、1果多蟲、與小卷蛾共生和危害新梢4個處理。每個處理分別取3齡、4齡和5齡取食活躍期和脫皮期幼蟲,以及老熟幼蟲各30—60頭,共3份材料,置于-80℃分別用于測試幼蟲下唇腺GOX活性、RNA和P含量。
1.2.1 幼蟲下唇腺提取液的制備
分別解剖1果1蟲、1果多蟲、與小卷蛾共生和危害新梢4個處理的梢斑螟幼蟲,取出下唇腺,在pH 7.0的磷酸緩沖液(0.05 mol/L)中冰浴研磨,4℃ 12000×g離心15 min,取上清液為下唇腺提取液。3齡幼蟲每樣品中有10頭幼蟲的下唇腺,其他齡期每樣品中有5頭幼蟲下唇腺,重復(fù)6次[13,19]。
1.2.2 下唇腺葡萄糖氧化酶活性測定
GOX活性測定參照Bergmeyer等方法[24],用UV-1240(uv mini)分光光度計測定。35℃條件下,反應(yīng)混合物包括:0.17 mmol/L 鄰聯(lián)茴香胺(Sigma),1.72%D-葡萄糖緩沖溶液(pH 7.0)2.9 mL,60 U/mL 辣根過氧化物酶(Roche)溶液和下唇腺提取液各0.1mL。用0.1 mL緩沖液代替下唇腺提取液為對照。在500 nm下連續(xù)記錄5 min反應(yīng)混合物的光吸收,計算每分鐘的光吸收變化并作圖,取線性變化范圍內(nèi)每分鐘變化值。蛋白質(zhì)濃度測定以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,用考馬斯亮藍染色法測定[19,25]。
式中,△A表示線性變化范圍內(nèi)每分鐘變化值;N表示酶液總體積;W表示蛋白質(zhì)含量(mg/mL);T表示光反應(yīng)時間(min);V表示加入的酶液體積。Ao表示鄰聯(lián)茴香胺在500 nm下的摩爾消光系數(shù),為7.5。
1.3.1 萜類成分的提取
根據(jù)Miller等的叔丁基甲基醚(TBME)浸提并甲酯化法(簡稱甲酯化法),選取0.3g球果或新梢樣品,加入1.5 mL叔丁基甲基醚(加150 μg/mL異丁基苯為內(nèi)標(biāo)),震蕩浸提14 h,過濾,用0.3 mL 0.1 mol/L的(NH4)2CO3(pH8.0)洗脫,取0.4 mL洗脫后的醚提取物,加0.16 mL甲醇和0.15 mL三甲基硅基重氮甲烷、密封,在室溫下放置30 min,再加入0.6 mL洗脫提取物,用裝有0.3g硅膠和0.2g無水硫酸鎂的巴斯德滴管過濾,用1 mL乙醚洗脫硅膠柱,所得樣品置于-20℃冰箱中待分析[23]。
1.3.2 GC-MS 分析
萜類分析利用美國Thermo-Finnigan公司的TraceDSQ氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS),色譜柱利用DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm ID,膜厚0.25 μm),載氣氫氣;流速 2 mL/min,F(xiàn)ID 溫度300℃,進樣口溫度 220℃,進樣1μL,分流比10∶1。起始溫度40℃,停留3 min,以3℃/min速率升溫至110℃,然后以10℃/min速率升溫至180℃,再以15℃/min速率升溫至250℃,保留10 min。質(zhì)譜條件:EI離子源,電離能70ev。各成分通過與譜庫(NISTZOOZ版)標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)譜圖核對并分析后,進行定性,根據(jù)內(nèi)標(biāo)法進行定量[2-4,23]。
1.4.1 RNA 提取和含量測定
采用顯微熒光測定法測試RNA含量。取3齡、4齡和5齡取食活躍期幼蟲各30頭(見1.1.2蟲源),每組蟲體的RNA用Trizol Reagent(Invitrogen)提取。RNA含量測定以酵母RNA為標(biāo)準(zhǔn),采用對RNA有高度特異性的熒光試劑Ribo-Green測定。具體方法(Ribo Green RNA quantitation reagent and Minicell Adaptor Kit(P/N 3800-928))為:將RNA樣品用TE稀釋后取1 mL與等體積1∶2000稀釋的RiboGreen試劑混勻,黑暗中放置5 min后在激發(fā)和發(fā)射波長分別為500 nm和525 nm條件下測定并記錄。所有RNA的含量均為占蟲體干重的百分比[21]。
1.4.2 P 含量測定
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取磷酸二氫鉀0.4407g配置標(biāo)準(zhǔn)品溶液(每1mL含磷10.05μg)。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2 和 1.5 mL 分別置試管中,各加水至 3 mL,搖勻;再分別加入定磷試劑(2.5% 鉬酸銨溶液∶3 mol/L 硫酸溶液∶水∶10%抗壞血酸=1∶1∶2∶1,用前配制)3 mL,搖勻;在 50℃水浴中反應(yīng) 25 min。以0 號管作為空白對照,用UV-1240(uv mini)分光光度計在650 nm測定各樣品液的吸光度。以溶液吸光度對其濃度作圖,得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
P含量的測定:采用抗壞血酸-鉬藍顯色定磷法測定蟲體中總P含量。取3齡、4齡和5齡取食活躍期幼蟲各30頭,將蟲體在50℃烘48 h后經(jīng)濃硫酸、濃硝酸硝化。樣品溶液與定磷試劑混合搖勻,測定樣品溶液的吸光度。利用磷標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總磷含量,樣品P含量為其占蟲體干重的百分比[21-22]。
數(shù)據(jù)用SPSS 10.0單因素方差(ANOVA)分析樣品間的差異顯著性,用a、b表示差異顯著(P<0.05);用A、B表示差異極顯著(P<0.01)。采用Sigmaplot 10.0作圖。
圖1為不同組織中松果梢斑螟幼蟲下唇腺GOX活性??梢钥闯觯紫x發(fā)育期內(nèi)GOX活性呈動態(tài)變化,1果1蟲、1果多蟲、與小卷蛾共生和新梢4個處理梢斑螟幼蟲GOX活性隨蟲齡而增加,有相同的變化趨勢。但在幼蟲脫皮期(每齡第4天)酶活性較低,取食活躍期(每齡第2天)酶活性顯著增加。3齡、4齡和5齡取食活躍期GOX活性依次極顯著升高(P<0.001),在5齡取食活躍期GOX活性最高,老熟幼蟲GOX活性最低。
新梢、1果1蟲、1果多蟲、與小卷蛾共生等不同部位,其同一齡期梢斑螟幼蟲GOX活性不同。3齡幼蟲中,與小卷蛾共生的幼蟲酶活性 >1果1蟲和1果多蟲的幼蟲酶活性 >取食新梢的幼蟲酶活性,但差異不顯著。4齡幼蟲中,與小卷蛾共生的幼蟲酶活性最高(0.62±0.04),取食新梢的幼蟲酶活性最低(0.42±0.08),取食球果(1果1蟲和1果多蟲)居中,三者差異顯著。但1果多蟲(0.50±0.02)和1果1蟲(0.55±0.05)的幼蟲酶活性差異不顯著。5齡幼蟲中,與小卷蛾共生的幼蟲酶活性最高(0.81±0.07),顯著高于新梢(0.57±0.05),其余之間差異不顯著。
圖2為蟲害油松球果和新梢單萜、倍半萜和雙萜含量變化??梢钥闯?,單萜、倍半萜和雙萜含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,球果的萜類含量隨蟲害時間延長而明顯下降。蟲害1 d時,新梢和球果單萜總含量均顯著增加(P<0.01),隨蟲害時間而逐漸降低,蟲害15 d時,單萜含量最低。作為新梢和球果單萜主要成分的1R-α-蒎烯和D-檸檬烯含量與單萜總含量有一致的變化趨勢,即蟲害后先升后降,最后與對照水平接近(圖1,表1,表2)。
表1 蟲害油松球果主要單萜成分含量隨時間的變化/(mg/g鮮重)Table 1 Changes of major monoterpene content with time in the infested cones
圖1 不同組織中梢斑螟幼蟲下唇腺葡萄糖氧化酶活性比較Fig.1 Glucose oxidase(GOX)activity in labial salivary glands of D.pryeri developed in four host tissues
油松球果和新梢中倍半萜含量較少,蟲害后倍半萜含量明顯下降。蟲害初期,球果中倍半萜含量沒有變化,隨后顯著下降;而新梢蟲害初期倍半萜含量略有增加,隨后明顯下降。倍半萜總含量,球果略高于新梢(圖1)。球果和新梢中主要倍半萜均為石竹烯、α-石竹烯和1-甲基-5-亞甲基-8-(1-異丙基)-1,6-環(huán)十二烯,其中石竹烯含量較大。在蟲害球果,初期(第1天)石竹烯增加,隨后顯著下降;而其它2種成分蟲害后顯著降低(表3)。蟲害后,新梢中的石竹烯顯著增加,隨后呈曲線波動;α-石竹烯蟲害后顯著增加,隨后降低;1-甲基-5-亞甲基-8-(1-異丙基)-1,6-環(huán)十二烯在蟲害初期含量變化不大,但在蟲害10 d后,該成分檢測不到(表4)。
表2 蟲害新梢主要單萜成分隨時間的變化/(mg/g鮮重)Table 2 Changes of major monoterpene content with time in the infested branches
圖2 松果梢斑螟幼蟲危害后油松球果及新梢萜類含量隨時間的變化Fig.2 Changes of terpene content with time in fested cones and branches
表3 蟲害球果主要倍半萜成分隨時間的變化/(mg/g鮮重)Table 3 Changes of major sesquiterpene content with time in the infested cones
圖2可以看出,球果蟲害后,雙萜含量顯著增加,后期明顯降低到正常水平。蟲害第1天雙萜含量達到最大(7.993 mg/g鮮重),是健康球果的1.7倍;蟲害5 d時雙萜含量是健康球果的1.4倍,第10天雙萜含量開始下降,第15天時接近健康球果水平。新梢蟲害后,其雙萜含量初期顯著增加,隨后逐漸接近健康新梢,但蟲害第15天時雙萜含量又顯著高于健康新梢(圖1)。蟲害球果和新梢顯著增加雙萜成分是松香酸甲酯、1-菲羧酸甲酯類和貝殼杉-16-烯-18-酸酯,新梢中松香酸甲酯含量較少。雙萜主要成分的變化趨勢與總含量一致:蟲害后顯著增加,后逐漸降低(表5,表6)。
表4 蟲害新梢主要倍半萜成分隨時間的變化/(mg/g鮮重)Table 4 Changes of major sesquiterpene content with time in the infested branches
表5 蟲害球果主要雙萜成分隨時間的變化/(mg/g鮮重)Table 5 Changes of major diterpene content with time in the infested cones
表6 蟲害誘導(dǎo)新梢主要雙萜成分隨時間的變化/(mg/g鮮重)Table 6 Changes of major diterpene content with time in the infested branches
根據(jù)生長率和蟲體RNA與P含量高度耦合的理論[21],測定取食不同處理食物的梢斑螟幼蟲RNA與P含量,可間接反映寄主食料對幼蟲生長發(fā)育的影響。表7可以看出,取食3種不同處理寄主食物的梢斑螟幼蟲,都以3齡幼蟲的RNA含量和P含量最高,其次是4齡幼蟲和5齡幼蟲,差異極顯著(P<0.01)。說明梢斑螟3齡幼蟲的生長率較快,之后逐漸變緩。
就取食部位來看,3個齡期幼蟲RNA含量均為:取食新梢幼蟲 <取食小卷蛾危害球果幼蟲<取食球果(1果1蟲和1果多蟲)幼蟲,但無顯著差異。就P含量來看,除4齡幼蟲外,取食球果的梢斑螟幼蟲P含量較高,取食新梢的幼蟲P含量較低,差異不顯著。說明3種處理食物對梢斑螟幼蟲生長率影響無顯著差異。
表7 取食寄主不同部位梢斑螟幼蟲RNA和P含量比較Table 7 RNA and P content comparison of pine comeworm larvae in different host tissue
在北方油松良種基地,每年7月,羽化的松果梢斑螟成蟲趨向蟲害(干枯的)球果附近產(chǎn)卵;翌年5月,小卷蛾幼蟲先期危害,引誘梢斑螟越冬幼蟲趨向正在發(fā)育的蟲害球果;同時,梢斑螟幼蟲也危害健康球果和新梢[1-2,4]。在林區(qū)條件下,本研究選擇梢斑螟與小卷蛾一起危害(與小卷蛾共生)的球果、有1頭梢斑螟幼蟲(1果1蟲)的球果、有2—3頭梢斑螟幼蟲(1果多蟲)的球果和梢斑螟危害新梢等4種處理,取食不同食料的梢斑螟幼蟲下唇腺GOX活性測試表明,4種食料均以5齡幼蟲GOX活性最高,顯著高于4齡和3齡幼蟲。并且,3個齡期的幼蟲均表現(xiàn)為:球果中與小卷蛾共生的梢斑螟幼蟲GOX活性 >球果中單一梢斑螟幼蟲酶活性>新梢中幼蟲酶活性,其中與小卷蛾共生的4齡和5齡幼蟲GOX活性顯著高于新梢內(nèi)的幼蟲。研究發(fā)現(xiàn),多食性鱗翅目幼蟲下唇腺GOX可顯著抑制植物的防御。并且,人工飼料飼養(yǎng)的幼蟲GOX活性顯著高于寄主植物上發(fā)育的幼蟲,同一昆蟲不同寄主上幼蟲GOX活性也顯著不同,反映了食料質(zhì)量(碳水化合物、蛋白等)影響幼蟲GOX活性水平[14,18-19],這與本研究結(jié)果一致。
雙萜(松脂酸)是針葉樹組成和誘導(dǎo)防御的主要物質(zhì),可作為植食性昆蟲的有毒成分而起到直接防御作用[26-28]。松脂萜類聚集在針葉樹特化的松脂道中,蟲害引起松脂道受損,伴有單萜揮發(fā)物的松脂在受害部位形成物理和化學(xué)障礙。而倍半萜在松脂中所占比例較?。?,28]。本研究結(jié)果顯示,雙萜(松脂酸)的基礎(chǔ)量最大(5.0 mg/g 鮮重左右),而倍半萜則很少(0.3—0.5 mg/g 鮮重),單萜在1.5 mg/g 鮮重左右;蟲害后,松脂酸變化在±2.5 mg/g鮮重,蟲害球果隨時間逐漸減少,第10天后低于2.7 mg/g鮮重;而新梢蟲害后,松脂酸初期顯著增加,隨后降低,最后顯著高于健康梢。蟲害后,單萜的情況類似雙萜,而倍半萜在蟲害球果和新梢中,總體是逐漸減少的。與球果比較,新梢的防御物質(zhì)(松脂酸)逐漸增加。以前研究中,比較了油松球果小卷蛾幼蟲危害后,蟲害球果萜類的變化,以及其它防御物質(zhì)的增加[2-3],在本研究中沒有比較2種害蟲危害油松球果防御反應(yīng)的差異。
與小卷蛾共生、油松球果和新梢3種食料的梢斑螟幼蟲RNA和P含量顯示,3齡幼蟲RNA和P含量最高,隨后逐漸減少,差異極顯著,說明前期幼蟲發(fā)育快,后期幼蟲發(fā)育慢,符合生長率與蟲體RNA和P含量高度耦合的生長率理論[21]。在3種食料中,3個齡期幼蟲RNA和P含量與食料密切相關(guān),但3種食料間幼蟲RNA和P含量(即生長率)無顯著差異,說明梢斑螟幼蟲可通過GOX調(diào)節(jié)和抑制植物的防御[10-15,18-20]。但3種食料對梢斑螟存活、蛹重和生殖的影響還不清楚[19]。下唇腺GOX的高抑制作用是多食性鱗翅目幼蟲應(yīng)對寄主誘導(dǎo)防御的對策[18],而GOX及其產(chǎn)物H2O2通過激發(fā)水楊酸(SA)途徑而抑制茉莉酸-乙烯(JA-ET)調(diào)控的植物防御,改變了植物基因表達,所以GOX能抑制寄主的直接和間接防御[12,20]。小卷蛾幼蟲的先期危害,激發(fā)了JA途徑調(diào)控的誘導(dǎo)防御,降低了食物質(zhì)量[3,5],但后來的梢斑螟幼蟲用GOX抑制松脂酸等防御物質(zhì)[20],使其生長率與健康球果、新梢中的幼蟲基本一致。
油松球果小卷蛾幼蟲的先期危害,引誘梢斑螟越冬幼蟲趨向球果取食[2],造成2種害蟲對食料的競爭。在競爭中,小卷蛾幼蟲處于劣勢而部分死亡,梢斑螟幼蟲的死亡率卻很低[1]。但是,由于小卷蛾幼蟲提前脫果下地,通過蟲害球果揮發(fā)物(間接防御)而引誘寄生蜂,使受害球果內(nèi)的梢斑螟幼蟲寄生率提高,說明趨向受害球果的梢斑螟幼蟲,面臨著天敵的威脅[1-2,6]。球果受害后,抗?fàn)I養(yǎng)、抗消化酶類和防御物質(zhì)增加,營養(yǎng)質(zhì)量下降[2-3],但本研究表明,梢斑螟幼蟲通過GOX活性抑制植物的防御,使不同食料的幼蟲生長率基本一致。后來羽化的梢斑螟成蟲,通過蟲害揮發(fā)物,趨向蟲害球果附近產(chǎn)卵[4]。進一步證明,蟲害寄主(誘導(dǎo)揮發(fā)物)暗示著競爭者和天敵的存在,寄主營養(yǎng)質(zhì)量的下降,也代表著潛在寄主的存在[6],說明后來者具有特殊的克服機制。
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