新型截短側(cè)耳素衍生物的體外抗菌活性研究*

趙 喜，王新楊，黃金華，凌 勇

（南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇226001）

金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是醫(yī)院感染中最常見(jiàn)的病原菌,可以引起敗血癥、菌血癥、呼吸道感染、人工關(guān)節(jié)感染、尿路感染、骨髓炎、傷口感染等多種疾病。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性呈上升趨勢(shì)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus epidermids,MRSE)在臨床上耐受多種抗菌藥物。截短側(cè)耳素是高等真菌擔(dān)子菌綱側(cè)耳素屬Pleurotus mutilus和Pleurotas passeck-rianus菌種經(jīng)深層培養(yǎng)產(chǎn)生的一種廣譜的二萜烯類抗生素，主要對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和支原體有活性作用[1]。為尋找抗耐藥菌的超級(jí)抗生素，本研究擬對(duì)已合成出的C-14位處側(cè)鏈上帶有雜環(huán)的一系列新型截短側(cè)耳素衍生物，進(jìn)行系統(tǒng)抗菌活性測(cè)試，為臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與菌株 阿莫西林（山東淄博新達(dá)制藥有限公司，批號(hào)101224），泰妙菌素（江蘇賽奧生化有限公司，批號(hào)110319），新型截短側(cè)耳素衍生物15，16a和 16b（本實(shí)驗(yàn)室合成）。MRSE,MRSA,甲氧西林敏感的表皮葡萄球菌 (methicillin-susceptible Staphylococcus epidermids,MSSE)及甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌 (methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA)菌株（臨床標(biāo)本分離菌株，由江蘇南京鼓樓醫(yī)院提供），MH培養(yǎng)基(北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，批號(hào)110217)；MH肉湯(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)110321)。

1.2 儀器 TDR-200B型自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng) (湖南長(zhǎng)沙天地人生物科技有限公司)；DL-CJ-1F實(shí)驗(yàn)醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司北京分公司)；DH3600AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；一次性使用培養(yǎng)板(江蘇姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：20090218)。

1.3 方法

1.3.1 藥液的制備:采用微量肉湯二倍稀釋法[2]：取8排12孔的一次性使用培養(yǎng)板，分別標(biāo)記，在標(biāo)號(hào)1～12孔中各加入MH肉湯培養(yǎng)液100 μL，在每排的第1 孔各加入原藥液 100 μL(50 μg·mL-1)，將第 1 孔混勻后，抽取100 μL加入第2孔，將第2孔混勻后再抽取100 μl加入第3孔，依次倍比稀釋至第10孔，將第10孔混勻后抽取100 μL棄去，第11、12孔分別作陽(yáng)、陰性對(duì)照。1～10孔中藥液濃度依次為：25．00、12．50、6．25、3.13、1.57、0.79、0.39、0.20、0.10、0.05 μg·mL-1。

1.3.2 菌液的制備:從已分離純化并過(guò)夜新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌平板上挑取4～5個(gè)菌落，接種于MH肉湯中增菌6 h。菌液用3 mL MH肉湯以比濁儀校正濁度至 0.5 McFarland，再用 MH肉湯稀釋至 1.5×105cfu·mL-1，作為試驗(yàn)菌液。

1.3.3 MIC的測(cè)定:用微量加樣器取100μL MRSA菌液，依次加入上述培養(yǎng)板第1～11孔中，使最終接種量為 5×105cfu·mL-1，37℃恒溫培養(yǎng) 18～20 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)液澄清的為陰性 (即無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng))，混濁的為陽(yáng)性（即有細(xì)菌生長(zhǎng)）。以無(wú)菌生長(zhǎng)96孔平板的最低藥物濃度為該藥對(duì)該株細(xì)菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)。

2 結(jié) 果

阿莫西林對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為4μg·mL-1，而新型截短側(cè)耳素衍生物15，16a,16b對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值均小于1μg·mL-1，抑菌效果明顯優(yōu)于阿莫西林,見(jiàn)表1。

表1 新型截短側(cè)耳素衍生物對(duì)金黃色葡萄球菌 MIC 值（μg·mL-1）

新型截短側(cè)耳素衍生物15，16a,16b對(duì)表皮葡萄球菌的最低抑菌濃度也明顯小于阿莫西林，且對(duì)MSSE和MRSE的MIC值相同，見(jiàn)表2。

表2 新型截短側(cè)耳素衍生物對(duì)表皮葡萄球菌 MIC 值（μg·mL-1）

3 討 論

截短側(cè)耳素具有良好的抗菌活性，1951年Kavanagh等[3]首次發(fā)現(xiàn)、定義并分離了這種結(jié)晶狀抗菌物質(zhì)，把它命名為Pleuromutilin。1974年Sandoz研究所在截短側(cè)耳素的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)半合成生成了高活性的動(dòng)物專用抗生素泰妙菌素(Tiamulin)，其水溶性和抑菌效果均較截短側(cè)耳素有較大提高，對(duì)志賀菌、克雷伯菌以及大腸埃希菌顯示較強(qiáng)活性，并被推薦為控制豬支原體感染首選藥物[4]。隨著全球?yàn)E用抗生素的趨勢(shì)越來(lái)越嚴(yán)重，耐藥菌感染引起的疾病引起科學(xué)家的極大重視，2007年葛蘭素公司以截短側(cè)耳素為原料開(kāi)發(fā)出了第一個(gè)人用截短側(cè)耳素類抗生素瑞他莫林(Retapamulin)，用于治療金葡萄球菌或化膿性鏈球菌引起的膿皰瘡[5-6]，該藥已于2008年在美國(guó)成功上市，商品名為Altargo，這是第一個(gè)人用截短側(cè)耳素衍生物，標(biāo)志著此類抗生素實(shí)現(xiàn)了從獸用到人用的飛躍。

隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，出現(xiàn)了大量的臨床耐藥致病菌。MRSA和MRSE都是醫(yī)院感染的重要致病菌，由于對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性,它導(dǎo)致的各種感染治療困難，病死率較高，因此，研究探索抗MRSA和MRSE的有效藥物已勢(shì)在必行。為了提高截短側(cè)耳素的水溶性和抑菌效果，本實(shí)驗(yàn)室合成了C-14位處側(cè)鏈上帶有雜環(huán)的一系列新型截短側(cè)耳素衍生物，并對(duì)這些衍生物進(jìn)行體外抗菌活性測(cè)定。結(jié)果顯示，新型截短側(cè)耳素衍生物15,16a,16b對(duì)MRSE、MRSA、MSSE和 MSSA均有較強(qiáng)的抑菌作用，最低抑菌濃度明顯小于阿莫西林和泰妙菌素，且新型截短側(cè)耳素衍生物15,16a對(duì)MRSA的MIC低于MSSA。我們還發(fā)現(xiàn)新型截短側(cè)耳素衍生物15,16a,16b對(duì)MSSE和MRSE的抑菌效果幾乎一樣，這可能給MRSE引起的感染提供了一種新的治療藥物，為今后合成抗菌作用更強(qiáng)的新型截短側(cè)耳素衍生物打下基礎(chǔ)。

[1]吳雪萍，孫鳳霞，蘇為科,等．截短側(cè)耳素的HPLC測(cè)定[J]．河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（1）：53-56.

[2]Murray PR，Baron EJ，Pfaller MA，et al．Antibacterial susceptibility tests：dilution and disk diffusion methods．Manual of clinical microbiology[M]．9th ed．Washington DC：ASM Press，2007：1110-1117．

[3]黃宇琪，張怡，胡昌華．截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的鑒定及發(fā)酵培養(yǎng)基初篩 [J]．四川大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版)，2008，45（3）：699-702.

[4]Hunt E.Pleuromutilin antibiotics[J].Drugs Fut,2000,25(11):1163-1168.

[5]劉黨生譯.治療人革蘭陽(yáng)性球菌皮膚感染的截短側(cè)耳素類抗生素Retapamulin[J]．國(guó)外醫(yī)藥:抗生素分冊(cè)，2008，29（1）：28-31．

[6]Ronald N，Jones RN,Thomas R,et al.Activity of retapamulin(SB-275833),a novel pleuromutilin,against selected t resistant gram-positive Cocci cocci[J]．Antimicrob Agents Chemother,2006,50(7)：2583-2586．