血管性癡呆大鼠腦血流、行為學和形態(tài)學對比及磁共振灌注成像的應用價值

張 嵐 ZHANG Lan

程敬亮2 CHENG Jingliang

2. 鄭州大學第一附屬醫(yī)院磁共振科 河南鄭州 450052

血管性癡呆（vascular dementia, VD）是指由各種腦血管疾病引起的智能損害和認知功能障礙的一種綜合征，主要表現(xiàn)為學習、記憶、思維等障礙。VD是老年性癡呆的第二位最常見原因，其患病率每5.3年增加1倍，僅次于阿爾茨海默病[1]。在我國，VD的發(fā)病率高于阿爾茨海默病，且發(fā)病率逐漸增加，給家庭和社會帶來沉重的負擔[2]。VD的發(fā)病機制目前尚不十分明確，但近年研究認為慢性腦低灌注是其主要發(fā)生機制之一，腦血流量下降與癡呆的嚴重程度密切相關(guān)[3]。因此，腦血流灌注測定是診治VD的有效指標，不僅能為VD的早期診斷及早期治療提供依據(jù)，而且對探討VD的發(fā)病機制和病理過程也有著重要作用。

隨著MRI技術(shù)的發(fā)展，磁共振灌注成像（perfusion weighted imaging, PWI）利用快速掃描技術(shù)和團注順磁性對比劑反映對比劑在腦微血管內(nèi)的血流動力學變化，獲取時間-信號強度曲線（TIC）和腦組織微循環(huán)參數(shù)，從而評價腦組織的血流灌注情況[4]。本研究旨在通過建立一種重復性和穩(wěn)定性較好、最大程度地模擬人類VD發(fā)病機制的動物模型，通過觀察其行為學、腦血流灌注及腦組織形態(tài)學變化，初步了解VD的病理生理過程，探討PWI在VD腦血流測定方面的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 36只雄性健康SPF級Wistar大鼠，體重240～280 g，由河南省實驗動物中心提供（合格證號：0003703），在河南中醫(yī)學院實驗室動物房分籠喂養(yǎng)，每籠4只，每天給予標準飼料，清潔自來水自由飲用。動物房環(huán)境溫度22～24℃，相對濕度70%左右，適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 實驗分組 將36只大鼠按體重大小編號，根據(jù)隨機數(shù)字表給每只大鼠一個隨機數(shù)字，然后按隨機數(shù)字區(qū)間進行分組，分為假手術(shù)組、VD模型術(shù)后15 d組、30 d組、45 d組，每組9只。術(shù)后死亡的大鼠被剔除本研究，并補足相應的大鼠數(shù)目。

1.3 實驗試劑及儀器 10%水合氯醛（上海富蔗化工有限公司），釓噴替酸葡甲胺注射液（Gd-DTPA，北陸藥業(yè)股份有限公司，15 ml/支）；跳臺實驗裝置（河南省中醫(yī)藥研究院）。

1.4 動物模型制作 參照Ni等[5]的方法，采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈的方法制作VD大鼠模型。大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，用10%水合氯醛按350 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定。頸部剪毛備皮消毒后切開，分離出雙側(cè)頸總動脈，用0號絲線雙重結(jié)扎，術(shù)中避免損傷交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)。假手術(shù)組大鼠僅行頸部切開，不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，術(shù)后正常飼養(yǎng)。在造模過程中保證大鼠自主呼吸，大鼠肛溫37℃左右。

1.5 認知功能測試 采用跳臺實驗檢測大鼠的學習和記憶能力。跳臺裝置為被動回避反應箱，四周用黑色塑料板分隔，箱底為可通電的銅柵，反應箱的右后角放置一個直徑和高均為4.5 cm的絕緣橡皮墊，作為大鼠回避電擊的安全臺。由調(diào)壓器調(diào)節(jié)電壓提供交流電，電壓為40 V。將大鼠放入跳臺裝置中自由活動3 min，然后接通電源持續(xù)5 min，大鼠受電擊后其正常反應是跳到安全臺躲避電擊。記錄通電后大鼠跳至安全臺所需時間為潛伏期，大鼠跳下安全臺的次數(shù)為錯誤次數(shù)，潛伏期和錯誤時間之和為受電擊總時間作為學習成績。24 h后重復上述實驗作為記憶成績。

1.6 腦血流測定 使用Philips Intera Achieva 1.5T超導型MRI儀，C3扁平表面線圈。將大鼠仰臥位固定在檢查床上，熱水袋保暖，大鼠頭部置于表面線圈的中心。以1 ml/s經(jīng)大鼠股靜脈團注Gd-DTPA（0.1 mmol/kg），采用FFE-EPI序列，TR 1200 ms，TE 30 ms，翻轉(zhuǎn)角40°，矩陣128×128，視野6 cm×5 cm，層厚2 mm，層間距0.2 mm，采集次數(shù)2次。選取4個層面，每個層面獲取50幅連續(xù)圖像，共得到200幅原始圖像。

在Philips Perfusion Analysis Tool工作站進行圖像后處理，描繪出TIC。局部腦血容量（regional cerebral blood volume, rCBV）值在rCBV圖上通過劃定感興趣區(qū)（ROI）求其信號強度平均值獲得，同樣獲得局部腦血流量（regional cerebral blood fl ow, rCBF）值。按照Kluytmans等[6]的方法，在rCBV、rCBF圖上的額葉皮質(zhì)、海馬區(qū)、小腦半球劃定相同大小的ROI，將額葉皮質(zhì)、海馬區(qū)與小腦半球的rCBV、rCBF值相比取其比值，代表相應區(qū)域的血流灌注程度。

1.7 病理檢查 各組大鼠在跳臺實驗和腦血流測定完成后斷頭取腦組織，用10%中性甲醛固定24 h，50%～100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5 μm切片，行HE染色及Nissl甲苯胺藍染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 12.0軟件，計量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況觀察 術(shù)后大鼠出現(xiàn)運動減少，行動遲緩，反應遲鈍，眼瞼下垂，眼裂變小，飲食減少。持續(xù)3～5 d后大鼠進食、精神、反應逐漸恢復正常。

2.2 行為學觀測結(jié)果 與假手術(shù)組相比，VD模型各組大鼠的學習和記憶能力明顯降低，學習成績中，VD模型30 d組、45 d組大鼠潛伏期及受電擊總時間延長，錯誤次數(shù)增多，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=28.968、16.773、15.184, P＜0.05）；記憶成績中，VD模型15 d組、30 d組、45 d組大鼠潛伏期、錯誤次數(shù)及受電擊總時間顯著增加，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=39.884、24.957、31.216,P＜0.05）。學習和記憶成績中，VD模型30 d組、45 d組大鼠潛伏期、錯誤次數(shù)及受電擊總時間與VD模型15 d組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且45 d組大鼠學習期的潛伏期較30 d組增加，記憶期的潛伏期和受電擊總時間較30 d組明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示各VD模型各組大鼠的學習和記憶能力隨著術(shù)后時間的延長，損害加重。各組大鼠跳臺實驗學習成績和記憶成績見表1。

2.3 血流灌注測定結(jié)果 VD模型15 d組、30 d組、45 d組大鼠額葉皮質(zhì)與海馬區(qū)rCBV比值和rCBF比值較假手術(shù)組降低，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.533、4.476,F=4.714、6.790, P＜0.05），見表 2 和圖 1、2。

表1 各組大鼠跳臺實驗學習成績和記憶成績比較

表2 各組大鼠額葉皮質(zhì)和海馬區(qū)rCBV比值和rCBF比值比較

圖1 各組大鼠腦rCBV圖。A～D依次為假手術(shù)組、VD模型15 d組、30 d組、45 d組。rCBV圖上黃色代表高血流灌注區(qū)域，黃色越淺說明血供越差，藍色代表低血流灌注區(qū)。VD模型15 d組、30 d組、45 d組與假手術(shù)組相比額葉、顳葉黃色區(qū)越來越淺淡，藍色區(qū)越來越明顯

圖2 各組大鼠腦rCBF圖。A～D依次為假手術(shù)組、VD模型15 d組、30 d組、45 d組。rCBF圖上黃色代表高血流灌注區(qū)域，黃色越淺說明血供越差，藍色代表低血流灌注區(qū)。VD模型15 d組、30 d組、45 d組與假手術(shù)組相比額葉、顳葉黃色區(qū)越來越淺淡，藍色區(qū)越來越明顯

2.4 TIC 由圖3可見，各VD模型組與假手術(shù)組比較，主波峰所對應的時間段基本一致，隨著術(shù)后時間的延長，曲線主波峰的幅度越來越低平、短小，且基線恢復緩慢。

2.5 病理組織學觀察 假手術(shù)組大鼠腦組織鏡下見皮層錐體細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常；海馬錐體細胞排列整齊密集，核仁清晰，Nissl染色見胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體豐富。VD模型15 d組鏡下見皮層變薄，部分錐體細胞變性；海馬CA1區(qū)錐體細胞層次減少，排列稀疏，胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體減少，有核固縮改變。VD模型30 d組鏡下見皮層錐體細胞變性，脫失；海馬CA1區(qū)錐體細胞變性，胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體進一步減少，細胞核固縮為三角形或多角形。VD模型45 d組鏡下見皮層錐體細胞變性、脫失現(xiàn)象顯著。海馬CA1區(qū)錐體細胞大部分變性、脫失，胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體大部分消失。見圖4～6。

3 討論

圖3 假手術(shù)組及各VD模型組TIC。A～D依次為假手術(shù)組、VD模型15 d組、30 d組、45 d組

圖4 各組大鼠海馬病理組織學改變（HE, ×400）。A.假手術(shù)組大鼠海馬錐體細胞排列整齊密集，層次豐富，核仁清晰，胞質(zhì)豐富；B.VD模型15 d組海馬CA1區(qū)錐體細胞層次減少，排列稀疏，有核固縮改變；C. VD模型30 d組海馬CA1區(qū)錐體細胞排列稀疏，細胞核固縮明顯；D. VD模型45 d組海馬CA1區(qū)錐體細胞大部分變性、脫失

圖5 各組大鼠海馬病理組織學改變（Nissl, ×400）。A.假手術(shù)組大鼠海馬錐體細胞胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體豐富，排列整齊；B. VD模型15 d組胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體減少，細胞核縮小，結(jié)構(gòu)不清；C. VD模型30 d組胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體進一步減少、消失；D. VD模型45 d組胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體大部分消失

圖6 各組大鼠額葉皮層病理組織學改變（HE, ×400）。A.假手術(shù)組大鼠額葉皮層錐體細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常；B. VD模型15 d組皮層變薄，部分錐體細胞出現(xiàn)核固縮；C. VD模型30 d組皮層錐體細胞變性，出現(xiàn)細胞脫失現(xiàn)象；D. VD模型45 d組皮層錐體細胞固縮，脫失現(xiàn)象明顯

VD是指各種腦血管疾病引起的獲得性智能損害綜合征。迄今為止對VD的發(fā)病機制尚不明確。既往研究認為大多數(shù)VD是由腦梗死所致。近年來，腦血流慢性持續(xù)性下降在VD發(fā)病機制中的作用逐漸受到關(guān)注，腦血流灌注及代謝測定是診治VD的有效指標。許多VD患者在出現(xiàn)癡呆癥狀之前，局灶性的低灌注和低代謝已經(jīng)存在，主要表現(xiàn)為以額葉、顳葉為中心的腦血流量下降，而且VD的癡呆程度與腦血流量和代謝率下降呈正相關(guān)，腦血流灌注下降越低，認知功能障礙越明顯，提示腦血流量儲備功能降低是VD發(fā)生的主要原因[7]。因此，建立一種接近于臨床上VD患者發(fā)病過程的動物模型對于研究VD的發(fā)病機制、病理生理學特點以及VD臨床的早期防治均有重要價值。雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎方法制備VD動物模型逐漸得到廣泛應用。經(jīng)DSA證實，此方法制作的VD模型，大鼠具有完整的Willis環(huán)，通過側(cè)支循環(huán)代償，造成穩(wěn)定的不完全性前腦缺血，腦的幕上部分血流優(yōu)先減少，而腦干灌注良好，維持生命中樞的基本功能，更接近慢性腦灌注不足時腦組織的病理生理演變過程[8]。

本實驗選取跳臺實驗評價大鼠的學習和記憶能力。跳臺實驗所檢測的是大鼠在多次訓練中學會尋找安全臺躲避，形成穩(wěn)定的空間位置認知，所形成的記憶是空間參考記憶?？臻g參考記憶是學習記憶的重要方面，也是判斷神經(jīng)系統(tǒng)功能的重要依據(jù)[9]。從信息的加工和提取方式來看，這種空間參考記憶屬于陳述性記憶，其儲存的機制主要涉及邊緣系統(tǒng)和額葉、顳葉等大腦皮層。而臨床VD患者正是陳述性記憶首先受損而且比較突出。研究報道，雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后，大鼠出現(xiàn)額葉、海馬等腦血流下降，伴隨大鼠的認知功能障礙，且進行性加重[10]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后15 d大鼠出現(xiàn)學習記憶障礙，且隨著缺血時間的延長逐漸加重，大鼠的學習和記憶能力持續(xù)降低，45 d時學習和記憶能力下降最為顯著，提示此模型誘導的慢性持續(xù)性腦血流灌注不足可以導致進行性和長期的學習和記憶功能障礙。

Tanaka等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù)后6周額葉皮層rCBF較對照組減少49%。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模術(shù)后15 d時大鼠額葉皮質(zhì)、海馬區(qū)rCBF比值即減少，隨著缺血時間的延長，rCBF持續(xù)降低，術(shù)后45 d時大鼠海馬區(qū)的rCBF下降最為顯著。因此，癡呆的程度與額葉、顳葉皮質(zhì)的rCBF灌注有關(guān)。rCBV減少反映單位質(zhì)量的腦組織內(nèi)血容量的減少，rCBV下降反映了血流灌注減低，是最直觀的指標[12]。本實驗中，VD模型30 d組、45 d組大鼠額葉皮質(zhì)與海馬rCBV持續(xù)下降，提示rCBV降低也與認知功能障礙密切相關(guān)。TIC顯示，隨著缺血時間的延長，曲線波幅越來越低平、短小，且基線恢復緩慢，提示VD模型各組的局部組織信號下降程度越來越小，即局部組織的血流灌注程度越來越低，血流灌注下降越來越顯著。

韓彥青等[13]采用簡易智能狀態(tài)量表（MMSE）評分與腦血流對比研究發(fā)現(xiàn)，血流灌注減低與MMSE評分呈正相關(guān)，提示VD腦血流的降低與智能活動關(guān)系密切。慢性低灌注狀態(tài)的持續(xù)存在損傷與智能有關(guān)的神經(jīng)纖維和神經(jīng)核團，導致VD的發(fā)生和發(fā)展，說明腦血流量減少和降低在癡呆的發(fā)生及發(fā)展中起到重要作用。PWI作為一種簡便易行的腦血流灌注的測定方法，對VD患者的腦血流進行動態(tài)觀察和監(jiān)測，以額葉、顳葉的血流灌注降低作為敏感指標，預測及早期發(fā)現(xiàn)VD，為VD病情的評估提供客觀依據(jù)，對于預防VD的發(fā)生、延緩其進展具有重要意義。

學習和記憶能力與大腦皮層和海馬密切相關(guān)，而大腦皮層與海馬CA1區(qū)最易受到缺血缺氧損傷[14]。因此，本實驗中同步觀察額葉、海馬區(qū)的病理組織學變化，隨著缺血時間的延長，錐體細胞變性、壞死、脫失的病理改變逐漸加重，海馬錐體細胞層變薄，細胞核固縮更加明顯，胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體逐漸消失。通過跳臺實驗證實大鼠出現(xiàn)進行性認知功能障礙，且與額葉皮質(zhì)及海馬區(qū)的神經(jīng)元細胞慢性進行性變性、脫失有關(guān)，且這種改變與慢性持續(xù)性腦血流量下降密切相關(guān)。

總之，慢性持續(xù)性腦血流下降是引起VD的重要原因之一，額葉皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元細胞慢性進行性變性是VD的病理基礎(chǔ)。PWI能較好地反映VD的腦血流變化。

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