甲胎蛋白異質(zhì)體3、高爾基體蛋白73及熱休克蛋白27在原發(fā)性肝癌中的診斷價(jià)值

黃琳淋 李光迪

蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730030

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer）是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，由于起病隱匿，發(fā)展迅速，確診時(shí)多數(shù)患者已經(jīng)處于癌癥晚期，治療效果不佳，死亡率高，每年有100 萬肝癌新患者，有11萬人死于肝癌，其全球發(fā)病率和死亡率分別列所有腫瘤的第5位和第3位[1]，發(fā)病率最高的國家大多在亞洲，其次在非洲等欠發(fā)達(dá)國家，大洋洲國家較低，美洲國家最低，且男性發(fā)病率高于女性，在我國，根據(jù)全國三次死亡回顧調(diào)查結(jié)果（1973-1975年；1990-1992年；2004-2005年） 肝癌在全部惡性腫瘤中的死亡順位分別為第3位、第2位、第2位，而農(nóng)村地區(qū)發(fā)病率高于城市地區(qū)[2]，東南高于西北、華北和西南地區(qū)，東南沿海高于內(nèi)陸[1]，嚴(yán)重威脅了人們的健康。目前除了影像學(xué)檢查外，肝癌的診斷和篩查主要依靠甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP），根據(jù)《2011年原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》：對于AFP≥400 ug/L 超過1個(gè)月，或是≥200 ug/L持續(xù)2個(gè)月，排除妊娠、生殖腺胚胎癌和活動性肝病，就高度懷疑肝癌。但是AFP 對診斷肝癌的敏感性不高，只有30%～60%[3]，且在其他一些腫瘤患者中也有發(fā)現(xiàn)AFP 異常增高。因此，AFP 對于診斷原發(fā)性肝癌的應(yīng)用十分受限。近年來，有學(xué)者通過大量的電泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌血清中都存在高爾基體蛋白73（GP73）、甲胎蛋白異質(zhì)體3（AFP-L3）及熱休克蛋白27（HSP27），該研究通過定量檢測原發(fā)性肝癌、肝轉(zhuǎn)移癌、胃癌中三種蛋白的表達(dá)情況，并與甲胎蛋白做對比，為探討它們在原發(fā)性肝癌中的診斷價(jià)值,現(xiàn)對甘肅省蘭州大學(xué)第二醫(yī)院2011年10月—2012年5月住院患者及健康體檢者進(jìn)行回顧性分析，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究共收集血清標(biāo)本98例，來自甘肅省蘭州大學(xué)第二醫(yī)院2011年10月—2012年5月住院患者及健康體檢者，男60例，女38例，年齡24～77歲，中位數(shù)為52.5歲，其中原發(fā)性肝癌36例，肝轉(zhuǎn)移癌14例，胃癌20例，健康對照28例。原發(fā)性肝癌、肝轉(zhuǎn)移癌、胃癌患者均為治療前抽血，健康對照組排除了肝炎患者，肝功、腎功異常者。疾病診斷符合2011版“原發(fā)性肝癌診療規(guī)范”。

1.2 主要試劑及儀器

GP73 酶聯(lián)免疫試劑盒，AFP-L3 酶聯(lián)免疫試劑盒，HSP27 酶聯(lián)免疫試劑盒；model AT-858型自動酶標(biāo)分析儀；Roche cobas 6 000 電化學(xué)發(fā)光儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 抽取待測者清晨空腹靜脈血3 mL，室溫靜置2h，3 500 r/min，離心10 min。分離血清置-50 ℃冰箱保存。

1.3.2 GP74、AFP-L3、HSP27 測定 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3.3 AFP 測定 采用Roche 發(fā)光試劑上機(jī)（Roche 2010 化學(xué)發(fā)光）定量檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組血清標(biāo)本檢測呈偏態(tài)分布，用中位數(shù)（95%參考范圍）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-Whitney 檢驗(yàn)。

圖1 AFP-L3 在各組中的表達(dá)情況

2 結(jié)果

2.1 各組血清標(biāo)本AFP-L3、GP73、HSP27 的檢測結(jié)果及比較

2.1.1 各組的檢測結(jié)果 肝癌組、肝轉(zhuǎn)移癌組、胃癌組、正常對照組血清標(biāo)本AFP、AFP-L3、HSP27、GP73 的表達(dá)水平（中位數(shù)及95%參考范圍），見表1。

2.1.2 各組間數(shù)據(jù)的總體比較 總體比較經(jīng)Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)顯示，原發(fā)性肝癌組、肝轉(zhuǎn)移癌組、胃癌組、對照組間AFP-L3、HSP27、GP73 三種蛋白含量不全相同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05（Chi-Square值：AFP-L3：62.862；HSP27：64.367；GP73：62.462）；原發(fā)性肝癌組的三種蛋白平均秩次明顯高于其他組。見圖1,2,3。

圖2 HSP27 在各組中的表達(dá)情況

圖3 GP73 在各組中的表達(dá)情況

表1 三種蛋白在各組標(biāo)本中的表達(dá)水平

2.1.3 Mann-Whitney 檢驗(yàn)兩兩比較 原發(fā)性肝癌組中AFPL3、HSP27、GP73 分別與其他三組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果如下，AFP-L3(U=3，Z=-5.38，P<0.05；U：48，Z=5.335，P<0.05；U=0，Z=-6.821，P<0.05），HSP27 （U=4，Z=-5.359，P<0.05；U=29，Z=-5.660，P<0.05；U=0，Z=-6.821，P<0.05）,GP73 （U=4，Z=-5.359，P<0.05；U=45，Z=-5.386，P<0.05；U：0，Z=-6.821，P<0.05）。肝轉(zhuǎn)移癌組、胃癌組及正常對照各組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 AFP-L3、GP73、HSP27 在原發(fā)性肝癌中的診斷價(jià)值

以各組三種蛋白水平繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）。AFP-L3 診斷原發(fā)性肝癌的曲線下面積為0.977，HSP27 診斷原發(fā)性肝癌的曲線下面積為0.985，GP73 診斷原發(fā)性肝癌的曲線下面積為0.978。AFP 在臨界值為400 ng/mL時(shí)，診斷原發(fā)性肝癌的靈敏度為66.7%,特異度為96.7%。

2.3 AFP-L3、HSP27、GP73 與AFP 間的相關(guān)性分析

實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)AFP-L3、HSP27、GP73 三種蛋白顏色的深淺與AFP的含量有明顯關(guān)系，為驗(yàn)證是否具有相關(guān)性，采用Spearman檢驗(yàn)，AFP 與AFP-L3、HSP27、GP73 的相關(guān)水平分別為：0.896、0.853、0.838，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 AFP-L3、HSP27、GP73 與乙肝表面抗原的相關(guān)性分析

原發(fā)性肝癌患者乙肝表面抗原表達(dá)情況為26例表面抗原陽性患者，10例表面抗原陰性患者，采用Spearman 檢驗(yàn)，乙肝表面抗原（HBV-SAg）與AFP-L3、HSP27、GP73 的相關(guān)水平(r)分別為：0.119、0.176、0.176，雙側(cè)檢驗(yàn)P值分別0.488、0.304、0.304，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

當(dāng)前，診斷原發(fā)性肝癌的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)主要依靠甲胎蛋白（AFP），但其靈敏度、特異度有限，學(xué)者們通過各種方法尋找原發(fā)性肝癌的特異指標(biāo)，其中甲胎蛋白異質(zhì)體（AFP-L3）、高爾基體蛋白73（GP73）、熱休克蛋白27（HSP27）是近年來的研究熱點(diǎn)。

根據(jù)AFP 分子存在糖鏈異質(zhì)性，通過凝集素親和電泳可把AFP 異質(zhì)體分成3個(gè)條帶，依據(jù)電泳遷移率大小，依次命名為AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3。AFP-L1 在良性肝病中占主要部分；AFP-L2 來自孕婦；AFP-L3 是由肝癌細(xì)胞產(chǎn)生[4]，因此AFP-L3的診斷靈敏度和特異度都應(yīng)高于AFP。高爾基體蛋白73（GP73）是美國學(xué)者Kladney 發(fā)現(xiàn)的一種新的跨膜糖蛋白，在正常肝臟中，GP73 主要是在匯管區(qū)的膽管上皮細(xì)胞中表達(dá)，在其他肝細(xì)胞中不表達(dá)表達(dá)或是表達(dá)微弱[5]。有學(xué)者[6]分析肝癌患者血清中GP73 的靈敏度和特異度，都明顯好于AFP，在肝轉(zhuǎn)移癌組中尤為明顯。趙建忠[7]等應(yīng)用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測GP73，研究發(fā)現(xiàn)，與AFP-L3 相比，原發(fā)性肝癌組具有更高的GP73 陽性率，而在肝硬化和肝炎組中GP73 的陽性率低于AFP-L3，因此血清中GP73 含量可能是比AFP-L3 更好的一個(gè)分子標(biāo)志物。熱休克蛋白27（HSP27）是低分子量熱休克蛋白家族成員，與藥物的抗性，細(xì)胞生長、凋亡，腫瘤的發(fā)生，轉(zhuǎn)移等功能密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激損傷，參與細(xì)胞增殖分化，抑制細(xì)胞凋亡，參與癌癥的發(fā)生,在細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)增加等，與腫瘤的惡性程度及預(yù)后有關(guān)[8-10]。Feng 等[11]結(jié)合了2-DE 和MALDI-TOF-MS/MS，分析了正常人、乙肝患者、HCC患者，鑒定出了8種差異蛋白，包括甲胎蛋白、熱休克蛋白27、叢生蛋白等，通過進(jìn)步一蛋白免疫印跡驗(yàn)證，HSP27 存在于90%HCC 中。

該研究結(jié)果顯示，AFP-L3、GP73、HSP27 在原發(fā)性肝癌中表達(dá)明顯高于肝轉(zhuǎn)移癌組、胃癌組及正常對照組，為評價(jià)三種蛋白對原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值，特做了ROC 曲線，HSP27 的曲線下面積最大。與甲胎蛋白相比，三種蛋白的診斷價(jià)值優(yōu)于甲胎蛋白。由于只選擇了腫瘤標(biāo)本，未選擇活動性肝炎、生殖系統(tǒng)腫瘤等AFP 出現(xiàn)假陽性的標(biāo)本，引起本試驗(yàn)特異度較高。該研究提示，AFP-L3、GP73、HSP27 與AFP 存在明顯的相關(guān)性，與某些研究不一致[12]，這可能與實(shí)驗(yàn)方法有關(guān)，這有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。其次，AFP-L3、GP73、HSP27 與乙肝表面抗原無明顯相關(guān)，即是患者否患有乙肝對三種蛋白的原發(fā)性肝癌的診斷無明顯影響。

總之，甲胎蛋白異質(zhì)體、高爾基體蛋白73、熱休克蛋白27 是診斷原發(fā)性肝癌的優(yōu)秀的候選血清標(biāo)志物，陽性率高，特異性好，操作簡單易行，在診斷原發(fā)性肝癌中具有較大的應(yīng)用價(jià)值，研究前景廣闊。

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