竹葉菜的組織培養(yǎng)研究

張麗英，朱 萍，郭 相，何 容，張微思

(中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南昆明650223)

竹葉菜，又名高大鹿藥、長柱鹿藥草(Smilacina atropurpurea)，為百合科(Liliaceae)鹿藥屬一種具根狀莖的多年生草本植物。竹葉菜高30～60 cm;根狀莖橫走，粗1.0～1.5 cm，莖橫折狀，上部或中部以上被粗短毛［1］。葉似竹葉，所以稱竹葉菜。

竹葉菜主產(chǎn)于四川東南部及云南西北部海拔2 100～4 000 m的高海拔地區(qū)。土壤為森林棕壤，酸性，pH 值 4.5 ～7.2［2］。在秋末果實成熟以后地上部分枯死，地下的根狀莖處于休眠狀態(tài)，在根狀莖上形成1～3個休眠芽。來年春夏之交(5月中旬～6月下旬)，當(dāng)氣溫回升以后，地下的休眠芽開始萌動，休眠芽萌發(fā)后形成的幼芽采集后捆成把即在市場上銷售。竹葉菜營養(yǎng)豐富，是理想的減肥保健食品［3－4］，其藥用價值也很高，全草供藥用，性寒，具清熱解毒，利尿消腫，潤肺等功效。竹葉菜作為一種野生蔬菜，在產(chǎn)區(qū)得到了當(dāng)?shù)赝林用窈统鞘芯用竦南矏?，但其繁殖系?shù)低、生長慢、目前難以人工栽培，使其進一步的開發(fā)利用受到限制。

組織培養(yǎng)可以在短時間內(nèi)通過少量的植株得到大量的可繁殖幼苗，很好的解決了資源有限、繁殖系數(shù)低、生長慢等問題，是竹葉菜資源可持續(xù)性利用的最好方法。本研究以帶地下根狀莖的芽做外植體，探索了竹葉菜的組織培養(yǎng)技術(shù)，建立其組培快繁體系，為今后進行竹葉菜規(guī)?；卦耘嗪蜕a(chǎn)提供種苗及技術(shù)貯備，為竹葉菜資源的可持續(xù)開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

滇西高山竹葉菜(Smilacina atropurpurea)，采自云南迪慶。見圖1、2。

圖1 竹葉菜

圖2 竹葉菜地下根狀莖

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

以MS為基本培養(yǎng)基，pH 值5.8～6.0，常規(guī)法配制。

1.2.2 外植體的消毒

取休眠地下莖上生長的頂芽為初始外植體，見圖1、圖2。用洗衣粉溶液洗去泥沙，然后加蓋紗布在自來水下小水沖洗1 h左右。移到超凈工作臺上，用75%酒精表面滅菌1 min，0.2%升汞浸泡16～18 min，無菌水沖洗7～10次。

1.2.3 芽外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)

切下頂芽(適當(dāng)帶一小塊地下根狀莖，以保證芽能成活)，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度20～24℃，光照時間13 h/d，相對濕度75% ～85%，光照強度2 000～4 000 lx的環(huán)境中進行培養(yǎng)。

1.2.4 誘導(dǎo)芽的繼代培養(yǎng)

將叢生芽和新梢切下來，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上進行繼代增殖培養(yǎng)。

1.2.5 幼苗的生根

外植體在增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)8～9周后，幼芽成為多分枝的叢生苗，取新梢接種到生根培養(yǎng)基上。

1.2.6 煉苗

先將移栽好的竹葉菜置于培養(yǎng)室中，待有一定適應(yīng)能力后再完全移至室外，適應(yīng)后即可移栽至田間進行栽培。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素水平對芽誘導(dǎo)的影響

將頂芽接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在前述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，芽的生長情況見圖4和表1。

表1 芽外植體在不同培養(yǎng)基上的生長情況

從表1可以看出，適合竹葉菜芽外殖體誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是 D5(MS+6－BA 1.5+NAA 0.05+0.6%瓊脂+3%蔗糖)。在D5中，外植體的出芽速度快，有1～2個叢生芽，芽生長健壯(見圖3)。

將D1和D4，D5相比，可以看出在竹葉菜芽誘導(dǎo)過程中6－BA配合NAA使用的效果比單獨使用6－BA的效果要好，并且6－BA/NAA的比值對芽的誘導(dǎo)有重要影響。如D2中6－BA/NAA的比值為5，D2出芽速度稍慢，叢生芽少;D4中6－BA/NAA的比值為7.5，芽多但出芽速度慢，而且出現(xiàn)基部膨大，有形成愈傷組織的傾向(見圖4);D5中6－BA/NAA的比值為30，出芽速度快，芽生長健壯，叢生芽多。說明6－BA/NAA的比值為30時較適合竹葉菜芽的誘導(dǎo)。李合生等［8－9］指出，當(dāng)分裂素/生長素比值高時，有利于誘導(dǎo)芽的分化，抑制衰老，但比值過高或過低都有礙外植體的生長誘導(dǎo)，無法達(dá)到最適宜的程度。由于時間有限，實驗未能繼續(xù)嘗試6－BA/NAA的比值高于30的激素配比。

D3中加了GA(赤霉素)，芽生長不夠健壯，說明在竹葉菜芽誘導(dǎo)培養(yǎng)不宜添加GA。

圖3 萌動的小芽

圖4 芽基部膨大

2.2 不同激素水平對芽的繼代培養(yǎng)的影響

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的小芽接入繼代培養(yǎng)基，在前述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，促進芽的進一步分化(見圖5)。

圖5 在三種培養(yǎng)基中的繼代情況

從表2可以看出，最適合竹葉菜芽繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基是 D2(MS+6 － BA 1.2+NAA 0.05+0.6%瓊脂 +3%蔗糖)。在D2中，芽的增殖倍數(shù)較高(3.43倍)，且出芽速度快，芽生長健壯;幼苗的葉泛綠，幼苗長勢好，生長快。D1為適合芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，但在進行繼代培養(yǎng)時增殖倍數(shù)相對較低，幼苗生長較緩慢。

表2 芽在不同繼代培養(yǎng)基上的生長情況

D3出現(xiàn)失綠現(xiàn)象。這可能是6－BA過高的緣故。有研究報道［10］，過高的細(xì)胞分裂素6－BA會影響小苗的生長，所以在組織培養(yǎng)時要適當(dāng)降低激素的濃度。D3中6－BA為1.5 mg/L，出現(xiàn)失綠;但D1中所加的6－BA也為1.5 mg/L，葉片卻泛綠。這可能是GA增強了6－BA在D3中的實際效果。GA對生長素和細(xì)胞分裂素的活性有增效作用［8，9］。由實驗可知6－BA濃度為1.2 mg/L～1.5 mg/L時可以保持竹葉菜組培幼苗葉片泛綠。

D3中還出現(xiàn)少量玻璃化現(xiàn)象。引起玻璃苗的可能原因主要集中在培養(yǎng)基水勢、激素種類和濃度、離子水平、溫度、光照等方面［11－14］。許多學(xué)者的研究報告指出，外源激素進入外植體，可能導(dǎo)致其激素含量過高，從而改變外植體內(nèi)的激素平衡狀況。生長素供應(yīng)過量也會誘導(dǎo)玻璃化［11－15］。本實驗中，D3較D1只多加了GA(赤霉素)，結(jié)果D3中出現(xiàn)了明顯的玻璃化，而D1中卻沒有。這可能是GA(赤霉素)與6－BA，NAA共同作用，增強了6－BA和NAA的效果，導(dǎo)致生長素供應(yīng)過量。因為目前沒有任何報道說GA(赤霉素)會引起玻璃化。

2.3 不同激素水平對幼苗生根的影響

將繼代培養(yǎng)產(chǎn)生的，長勢較一致的幼苗接入生根培養(yǎng)基，在前述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)幼苗生根。

表3 幼苗在不同培養(yǎng)基上的生根情況

從表3還可以看出，NAA與IAA(主要促進細(xì)胞伸長，一般不促分裂)配合，比NAA與6－BA配合，以及NAA與IAA和6－BA同時配合，其生根效果要好(見圖6)。適合竹葉菜無菌體小苗生根的培養(yǎng)基是 D3(MS+IAA 1.5+NAA 0.2+0.6%瓊脂 +3%蔗糖)。在D3中，幼苗易生根，根粗且長，且生長速度快(見圖7)。李合生等指出NAA可以促進細(xì)胞伸長和細(xì)胞分裂，有促進生根的作用［8，9］。NAA可配合6－BA使用，當(dāng)6－BA/NAA比值低時，有利于根的分化。

圖6 小苗在生根培養(yǎng)基中的生長情況

圖7 小苗在D3培養(yǎng)基中的生根情況

3 討論

在以竹葉菜的頂芽為外植體的組織培養(yǎng)過程中，適合竹葉菜芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是:MS+6－BA 1.5+NAA 0.05+0.6%瓊脂+3%蔗糖;繼代培養(yǎng)基是:MS+6 －BA 1.2+NAA 0.05+0.6% 瓊脂 +3%蔗糖;生根培養(yǎng)基是:MS+IAA 1.5+NAA 0.2+0.6%瓊脂+3%蔗糖。

繁殖中間體的誘導(dǎo)一般可通過三條途徑:器官發(fā)生途徑、愈傷組織誘導(dǎo)及分化再生途徑、胚狀體發(fā)生途徑［16－18］。考慮到竹葉菜葉的角質(zhì)層較厚，葉較硬，不適合用于誘導(dǎo)愈傷組織，而且產(chǎn)生愈傷組織的周期較長，愈傷組織誘導(dǎo)及分化再生過程中易發(fā)生變異，近年來人們對由愈傷組織分化出苗會帶來變異的擔(dān)心在不斷增加。所以本試驗選用帶地下根狀莖的芽作為外植體進行組織培養(yǎng)，通過以芽生芽，形成叢生芽，從而建立繁殖中間體。一般來說，只要培養(yǎng)基適合，用腋芽或頂芽作外殖體比較容易成功［16，19］。

在外植體培養(yǎng)過程中污染較為嚴(yán)重，污染率達(dá)30% ～40%。分析其原因，可能是:竹葉菜的植株較大，地下莖上覆土較多且長有大量的須根，將須根除去才好徹底清洗和消毒。但這會使外植體上留下切口，細(xì)菌從切口侵入，造成污染;其外植體較大，在滅菌過程中易出現(xiàn)滅菌不徹底;外植體在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)很多的內(nèi)生細(xì)菌，使得滅菌更加困難。如果要得到很好的組織培養(yǎng)效果，就需要在外植體取材方面進行著手，盡量獲得比較細(xì)嫩且健壯的外植體;在清洗時要盡量先清洗干凈再除須根;提高升汞濃度，延長升汞處理時間，盡可能徹底地滅菌(經(jīng)過不斷摸索，發(fā)現(xiàn)用0.2%升汞浸泡16～18min的滅菌效果是最好的);接種時每瓶所接芽數(shù)不宜多，最好不超過3個，通過降低污染概率來降低污染率;發(fā)現(xiàn)瓶內(nèi)有內(nèi)生菌時，對尚未被污染的外植體要及時地轉(zhuǎn)接;還要求操作人員操作正確、熟練，避免操作過程中造成污染。

竹葉菜的芽具有較強的休眠性，在實驗過程中曾試圖用GA(赤霉素)打破芽的休眠。但從實驗結(jié)果來看，在竹葉菜組織培養(yǎng)過程中，不宜在培養(yǎng)基中添加GA(赤霉素)，添加雖然可以在一定程度上提高出芽率和出芽速度，但會使芽生長不夠健壯，幼苗出現(xiàn)失綠和玻璃化現(xiàn)象。

經(jīng)過幾次繼代培養(yǎng)后，幼芽成為多分枝的叢生苗，再繼代分化時分化速度和分化率都降低，增殖的速度減慢。這時應(yīng)及時繼代，以免組織老化［19］。同時將可以生根的幼苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基。

煉苗時，要注意仔細(xì)洗去附著在幼苗根部上的培養(yǎng)基，將生根幼苗移植在采自竹葉菜生境地的土壤上，剛開始的時候周圍溫度與培養(yǎng)時溫度的差值不能超過5℃。逐步降低周圍的溫度，直到移栽幼苗適應(yīng)室溫。管理過程中每隔兩天要澆一次水，但每次澆水不能多，以免爛根。這是移栽成活的關(guān)鍵。通過試驗和觀察、統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)在組培過程中竹葉菜的生長周期長、生長比較緩慢;喜愛低溫、高濕度、短光照的生長環(huán)境。

致謝:云南大學(xué)李宗菊老師和云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院嚴(yán)家云老師對本實驗給予了大力支持和幫助，在此表示感謝。

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