不同采收期東北鐵線蓮藥材中靈仙新苷的含量變化研究

史 記，管 越，周 洋，董彩霞，姚 嵐，劉麗芳

東北鐵線蓮(Clematis manshurica Rupr.)為毛茛科鐵線蓮屬多年生草本植物，其干燥根和根莖是2010版中國(guó)藥典收載藥材威靈仙的3個(gè)主要來(lái)源之一(另2個(gè)來(lái)源為威靈仙 Clematis chinensis Osbeck.、棉團(tuán)鐵線蓮 C.hexapetala Pall.的根和根莖)。別名東北威靈仙、辣蓼鐵線蓮、山辣椒秧子，一般用根部入藥，地上莖也可以食用。生于山野林邊、田埂及路旁。分布于我國(guó)東北、山西、山東、河北、內(nèi)蒙古東部;朝鮮、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)也有分布。它是習(xí)用傳統(tǒng)中藥，味辛咸、性溫，具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛的功效。主要用于治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)不利等證。現(xiàn)代研究表明東北鐵線蓮中含多種皂苷類成分［1－4］，已報(bào)道的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示皂苷類成分是該藥材發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛活性的主要有效成分［5－7］。靈仙新苷(Clematichinenoside AR，以下簡(jiǎn)稱AR，分子量為1806，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。)是威靈仙藥材中提取的一種主要皂苷類成分，我們前期的藥理研究結(jié)果表明，靈仙新苷對(duì)弗氏佐劑引起的大鼠免疫性炎癥的繼發(fā)病變具有顯著的治療作用［8］。目前已有的報(bào)道中，AR僅在毛茛科鐵線蓮屬植物中發(fā)現(xiàn)，其含量高低對(duì)于威靈仙藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)具有十分重要的意義。

圖1 靈仙新苷(AR)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

為合理開(kāi)發(fā)東北鐵線蓮，確定其質(zhì)量的優(yōu)劣和最佳采收期，我們采用HPLC法測(cè)定了不同時(shí)期采收藥材中AR的含量，以研究其在東北鐵線蓮根中含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為該藥材的質(zhì)量控制和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

采自吉林省舒蘭市亮甲山鄉(xiāng)，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)劉麗芳教授鑒定為東北鐵線蓮的根及根莖。藥材從5月末采集到10月中旬，共計(jì)取樣13次，所有樣品去泥粉碎，過(guò)40目篩備用。

1.2 儀器

Agilent1200液相色譜儀(美國(guó));Diamonsil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，美國(guó)迪馬公司)，AUY120型電子分析天平(日本Shimadzu公司)，KH－250DB超聲清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);RE52CS－1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司，HH－4);靈仙新苷(clematichinenoside，AR)對(duì)照品(自制，純度 ＞98%，HPLC法);純凈水(娃哈哈純凈水);乙腈(Merck公司，色譜純);甲醇(分析純，南京化學(xué)有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取AR對(duì)照品約10.0 mg，精密稱定后用30%乙腈溶解并定容至10 mL，制成每毫升含1.026 mgAR的溶液。

2.2 樣品溶液的制備

將東北鐵線蓮藥材粉碎，過(guò)40目篩，取約0.5 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加入50%甲醇20 mL，加熱回流提取2次，每次1.5 h，過(guò)濾，合并濾液減壓濃縮至干，冷卻至室溫，用30%乙腈溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，混勻，過(guò)0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3 樣品溶液提取方法的考察

2.3.1 提取方法的優(yōu)選設(shè)計(jì)

經(jīng)考察50%甲醇提取優(yōu)于水和乙醇提取，加熱回流的方法優(yōu)于超聲和冷浸，為系統(tǒng)考察各種因素對(duì)提取結(jié)果的影響，采取正交實(shí)驗(yàn)，考察溶劑倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素，測(cè)定AR的含量，按四因素三水平進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。各因素水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差見(jiàn)表2、表3。

表1 東北鐵線蓮甲醇提取正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 提取方法考察方差分析表

由表2、表3可以看出影響東北鐵線蓮AR提取的主次因素為A＞B＞C，A和B兩因素均有顯著性差異，從均值K可以看出最佳提取方案為A2B3C2。即20 mL的50%甲醇，加熱回流提取2次，每次1.5 h。2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳提取條件，即100 mL的50%甲醇，加熱回流提取2次，每次1.5 h，平行三組放大5倍的量進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)定AR含量為2.1%和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的較優(yōu)組2.12%含量相似，且RSD=1.53%，表明此正交實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)組合符合實(shí)際。此外，在其他條件不變的情況下追加提取時(shí)間為2 h的情況，得AR含量為2.01%，并未高于提取時(shí)間1.5 h每次，進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.4 測(cè)定方法

色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5μm)柱;流動(dòng)相:乙腈(A)－水溶液(B)，梯度洗脫程序(見(jiàn)表4);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL。

表4 梯度洗脫程序

圖2 AR對(duì)照品色譜圖

圖3 樣品色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸取對(duì)照品溶液 1.25，2.5，5，7.5，10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加30%乙腈稀釋至刻度，搖勻，分別配成 0.13，0.26，0.51，0.77，1.026 mg/mL 的系列對(duì)照品溶液;分別精密吸取上述不同濃度對(duì)照品溶液20μL注入色譜儀，按照上述色譜條件測(cè)定，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，AR濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為 A=3 381.6C－50.752，r=0.9992，表明 AR 濃度在 0.13 ～ 1.026 mg/mL內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度考察

精密吸取AR的對(duì)照品溶液20μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示該方法的精密度良好(RSD=0.67%，n=6)。

2.7 重復(fù)性考察

取同一批東北鐵線蓮樣品，平行稱定6份，按照2.2操作，每份精密吸取20μL，同法測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果顯示6份樣品中AR的平均含量為4.47%，RSD=0.77%(n=6)，表明該方法重復(fù)性較好。

2.8 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液分別在 0，0.5，5，7.5，10 h內(nèi)同法測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果表明RSD為0.81%，表明樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率考察

取已知含量的東北鐵線蓮藥材粉末適量，精密稱定6份，分別精密加入AR對(duì)照品適量，同法制備樣品溶液，進(jìn)樣20μL，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，AR的平均回收率為102.9%，RSD=1.6%(n=6)，表明該法的準(zhǔn)確度較好。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同采收期樣品中AR的含量變化

取不同時(shí)期采收的樣品，按上述方法制備樣品溶液，同法進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算藥材中AR的含量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，圖4。

表5 不同采收期樣品中AR的含量

圖4 不同采收期樣品中AR含量

4 討論

從表5和圖4可知，AR含量變化為5月末較高，7月末較低然后逐漸遞增，直至9月初達(dá)到頂點(diǎn)，然后緩慢下降。AR為三萜皂苷，是次生代謝產(chǎn)物，它在東北鐵線蓮根內(nèi)的積累可能與日照、溫度、水分、土壤狀況等多種環(huán)境因素有關(guān)。有關(guān)報(bào)道表明［9］，適度遮蔭有利于東北鐵線蓮生長(zhǎng)發(fā)育，有利于三萜皂苷的積累，但光照太弱則會(huì)影響還原糖的生成，進(jìn)而影響皂苷的生成。5月末和8月末到9月中旬的日照均處于適中的強(qiáng)度，利于AR的積累。吉林地區(qū)最熱的是7月，降水集中在6至8月。適度干旱能刺激植物中次生代謝產(chǎn)物的積累，三萜皂苷的含量也會(huì)上升，和結(jié)果中的降水量不多的8月末到9月中旬AR含量高相符。適度的高溫利于植物中三萜皂苷的合成，所以溫度適宜的5月底、8月底到9月中旬AR含量均較高。此外，東北鐵線蓮的花期是6～8月，7月最盛，果期是7～9月，可推測(cè)AR可能在開(kāi)花時(shí)含量較低，而結(jié)果時(shí)含量較高。

另外，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，AR主要存在于東北鐵線蓮根的皮部中(高達(dá)7.2%)，木部中未檢測(cè)到AR。這個(gè)現(xiàn)象也為5月底、8月底到9月中旬藥材中AR含量相對(duì)較高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了佐證，我們推測(cè)可能是由于在這2個(gè)時(shí)間段內(nèi)，由于日照、溫度、降水等環(huán)境因素的影響，有利于東北鐵線蓮根皮部的次生代謝產(chǎn)物的形成，故在此期間，藥材中該成分的含量相對(duì)較高。

東北鐵線蓮最佳采收期可以參考AR含量較高的8月下旬到9月中旬(8.25～9.15)為宜，這對(duì)保證藥材質(zhì)量具有重要的意義。

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