大孔樹脂吸附法純化黃芪總皂苷的工藝研究

蔣思德，夏玉鳳*，戴 岳

(1.中國藥科大學(xué)中藥分析教研室;2.中國藥科大學(xué)中藥藥理教研室，江蘇南京210009)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪［Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］或膜夾黃芪［Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.］的干燥根。具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血等功效［1］。其化學(xué)成分主要有皂苷、多糖和黃酮類等，其中以黃芪甲苷為主的黃芪總皂苷是黃芪的主要有效部位，現(xiàn)代藥理研究表明黃芪皂苷在抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗肺纖維化作用等方面有顯著活性［2－6］。大孔吸附樹脂是20世紀60年代末發(fā)展起來的分離純化技術(shù)，具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、選擇性好、比表面積大、吸附容量大等優(yōu)點。在中藥化學(xué)成分提取，特別是皂苷類成分的富集純化方面被廣泛使用和推廣［7－8］，其較傳統(tǒng)的正丁醇萃取法有有機溶劑使用少、工藝簡便、所得皂苷純度高等優(yōu)點。本研究采用靈敏度較高的HPLC－ELSD檢測法，以黃芪甲苷作為工藝研究的考察指標，對大孔樹脂富集純化黃芪總皂苷的工藝條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和材料

1.1.1 實驗儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Aglient);Alltech 3300 ELSD蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD，美國Alltech);BSA124S分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);R201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市英峪高科儀器廠)。

1.1.2 實驗材料

黃芪飲片，購于南京藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)中國藥科大學(xué)夏玉鳳副教授鑒定為豆科植物蒙古黃芪［Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］的干燥根;黃芪甲苷對照品，純度≥98%，購自南京澤朗生物醫(yī)藥科技有限公司;D101，AB－8，DA201大孔吸附樹脂，購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司;乙腈為色譜純，購于德國Merk公司;甲醇、正丁醇、氨水等均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理

取大孔吸附樹脂，用95%乙醇浸泡24 h，除去懸浮物及雜質(zhì)，濕法裝柱，用95%乙醇洗至洗脫液與水(1∶2)混合不產(chǎn)生渾濁，或置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干時無殘渣。再用水洗至無醇味，備用。

1.2.2 樣品溶液的制備

取黃芪藥材飲片適量，加8倍量70%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑后得浸膏。用適量水充分溶解后，4000 r·min－1下離心 10 min，取上清液，得到每 1 mL 含0.5 g生藥的樣品溶液。

1.2.3 黃芪甲苷的測定

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱為 Agilent C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈 － 水(38∶62)，流速為 1.0 mL·min－1，進樣量20 μL;漂移管溫度為75 ℃，氮氣流速 1.5 L·min－1。

1.2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為 0.31 mg·mL－1的對照品溶液。

1.2.3.3 標準曲線的繪制

精密量取黃芪甲苷對照品溶液 0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 mL 置1 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度。分別精密吸取各對照品溶液20μL注入液相色譜儀，按“1.2.3.1”項下色譜條件進行測定。以進樣量(μg)的常用對數(shù)值為橫坐標(X)，以對照品峰面積的常用對數(shù)值為縱坐標(Y)，進行線性回歸，得回歸方程為:

Y=1.351 4 X+2.308 8，r=0.999 3。結(jié)果表明黃芪甲苷在1.86～4.96μg的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

1.2.3.4 供試品溶液的制備

取樣品溶液10 mL置分液漏斗中，以水飽和的正丁醇萃取4次，每次20 mL，合并正丁醇萃取液。用25%氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去氨水層。再用正丁醇飽和的水洗滌2次，棄去水層，將正丁醇層減壓回收至干，用甲醇溶解并定容至10 mL，得供試品溶液。并測得此方法的重復(fù)性為RSD=3.03%(n=6)，表明此方法的重復(fù)性良好。

1.2.3.5 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液，重復(fù)進樣6次，按上述色譜條件測定，其峰面積的RSD為1.78%，表明儀器的精密度良好。

1.2.3.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h進樣，按上述色譜條件測定，其峰面積的RSD為1.84%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.3.7 加樣回收率實驗

取已知含量的同一樣品溶液6份，分別精密加入對照品溶液適量，按照上述方法進行處理后測定，測得黃芪甲苷的平均加樣回收率為103.67%，RSD=3.7%。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂型號的篩選

取預(yù)處理好的D101，AB－8，DA201大孔吸附樹脂各5 g(濕重，瀝干水分)，分別裝于同一規(guī)格的層析柱(18 mm×200 mm)中。取樣品溶液(0.5 g生藥/mL)75 mL，以3 BV·h－1流速進行動態(tài)吸附，完全吸附后靜置2 h。用100 mL水洗后，再用100 mL 70%的乙醇進行洗脫，收集乙醇洗脫液，按“1.2.3”項下方法測定黃芪甲苷的含量，結(jié)果見表1。

表1 大孔吸附樹脂型號篩選結(jié)果

結(jié)果表明D101樹脂對黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率大于其余兩種樹脂，因此優(yōu)選D101樹脂來純化黃芪總皂苷。

2.2 動態(tài)吸附條件考察

2.2.1 上樣量的確定

取預(yù)處理好的D101樹脂裝柱，將總體積為480 mL的樣品溶液，以3 BV·h－1的流速進行動態(tài)吸附，收集流出液，每40 mL收集一份，按“1.2.3”項下方法測定每份中黃芪甲苷的含量。以收集的流份數(shù)為橫坐標，黃芪甲苷的泄露百分率為縱坐標，繪制泄露曲線，結(jié)果如圖1。

圖1 黃芪甲苷的泄露曲線

由泄露曲線可知，上樣至第6份時，黃芪甲苷已開始明顯泄露，因此確定最大上樣量為240 mL，即1 g樹脂可吸附10.79 mg黃芪甲苷。

2.2.2 吸附流速的考察

取預(yù)處理好的D101型大孔吸附樹脂5份，每份13.5 g(濕重，約 20 mL)裝柱，0.5 g生藥/mL 的樣品溶液 240 mL，分別按 1 BV·h－1、2 BV·h－1、3 BV·h－1、4 BV·h－1、5 BV·h－1進行動態(tài)吸附，完全吸附后靜置2 h。先用200 mL水洗，再用100 mL 70%的乙醇進行洗脫，洗脫流速為3 BV/h，收集醇洗脫液，測定其黃芪甲苷的量，結(jié)果見表2。

表2 吸附流速考察結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸附流速為2 BV·h－1時，D101大孔樹脂對黃芪皂苷的轉(zhuǎn)移率最大，故優(yōu)選2 BV·h－1作為上樣流速。

2.3 動態(tài)洗脫條件考察

2.3.1 洗脫溶劑的考察

取已處理好的D101樹脂裝柱，按優(yōu)化的動態(tài)吸附條件完全吸附后后靜置2 h。先用水洗至Molish反應(yīng)呈陰性，再依次用20%、30%、50%、70%和95%乙醇各100 mL洗脫，洗脫流速為3 BV·h－1，收集各洗脫液，按“1.2.3”項下方法測定黃芪甲苷的含量，結(jié)果分別為 0、0、3.37、19.28、23.79、3.54mg。由此可見，黃芪總皂苷集中在50% ～70%的乙醇濃度下被洗脫，并且70%乙醇的洗脫能力更強，因此選擇70%乙醇作為洗脫溶劑。而水和20%乙醇洗脫液中未檢測到黃芪甲苷，可作為除雜洗脫劑。

2.3.2 洗脫體積的考察

取已處理好的D101大孔吸附樹脂裝柱，按優(yōu)化的動態(tài)吸附條件完全吸附后靜置2 h。用蒸餾水洗至Molish反應(yīng)呈陰性，5 BV 20%乙醇除雜，再用70%乙醇洗脫，每20 mL(相當(dāng)于1 BV)收集1份，測定其中黃芪甲苷的量，結(jié)果如圖2。

圖2 黃芪甲苷的洗脫曲線

由圖2可知，在第5 BV時，大部分黃芪甲苷被解吸下來，黃芪甲苷的累計洗脫率達到90%以上，故確定洗脫劑用量為5倍樹脂柱體積。

2.3.3 洗脫流速的考察

取處理好的D101型大孔吸附樹脂5份，按優(yōu)化的動態(tài)吸附條件完全吸附后后靜置2 h。先用10BV水洗脫，5 BV 20%乙醇除雜，再用5 BV 70%乙醇進行洗脫，洗脫流速分別為 1 BV·h－1、2 BV·h－1、3 BV·h－1、4 BV·h－1、5 BV·h－1，收集醇洗脫液，測定黃芪甲苷的量，結(jié)果如表3。

表3 洗脫流速考察結(jié)果

由表3可知，當(dāng)洗脫流速為4 BV·h－1時，D101吸附樹脂對黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率最高，因此選用4 BV·h－1的流速作為洗脫流速。

2.4 驗證試驗

取已處理好的D101型大孔吸附樹脂3份，每份13.5 g(濕重，約 20 mL)裝柱，0.5 g生藥/mL 的樣品溶液240 mL，按2 BV·h－1進行動態(tài)吸附，完全吸附后靜置2 h。用10 BV水洗至Molish反應(yīng)呈陰性，5 BV 20%乙醇除雜后，再用5 BV 70%的乙醇進行洗脫，洗脫流速為4BV·h－1，收集醇洗脫液，按“1.2.3”項下方法測定黃芪甲苷的含量，結(jié)果如表4。

表4 驗證試驗結(jié)果

由驗證試驗的結(jié)果可見，采用D101型大孔樹脂純化黃芪總皂苷的工藝穩(wěn)定可靠。樣品溶液中黃芪甲苷的純度為0.15%，經(jīng)純化后其純度達到4.68%，純度提高了31倍，黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率高達93.21%。表明用D101型大孔吸附樹脂富集純化黃芪總皂苷是可行的。

3 結(jié)論

通過動態(tài)吸附和解析法，發(fā)現(xiàn)非極性的D101樹脂最適于黃芪總皂苷的純化，其工藝條件為:黃芪甲苷的上樣量為 10.79 mg/g樹脂，以 2 BV·h－1的吸附速率上樣，完全吸附后靜置2 h。用10 BV水洗至Molish反應(yīng)呈陰性，用5 BV 20%的乙醇除雜，再用5 BV 70%的乙醇以4 BV·h－1流速進行洗脫，所得黃芪總皂苷純化效果最好。

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