七葉一枝花種子萌發(fā)特性研究

張旺凡，沈素貞，梁文斌，張 睿

(1.湖南中醫(yī)藥高等專科學校，湖南株洲412012;2.中南林業(yè)科技大學，湖南長沙410004)

七葉一枝花［Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara］又名華重樓，屬延齡草科重樓屬多年生草本植物，是《中國藥典》2005年版收載的藥用重樓品種之一［1］，分布于湖南、江西、浙江等地，多生于海拔700～1 300 m的山坡、灌木林或溪邊、濕地肥沃的沙壤土和腐殖質(zhì)土壤［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明該中草藥具有抗腫瘤、止血、止咳平喘、免疫調(diào)節(jié)、抗菌消炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及調(diào)節(jié)心腦血管等作用［3］，是云南白藥、宮血寧片、三七血傷寧膠囊、蓮花片、止痛抗癌丸、季德勝蛇藥片和抗病毒沖劑等中成藥的主要原料，具有較高的經(jīng)濟效益和社會效益。

隨著研究的深入，七葉一枝花的藥用價值越來越受到人們的重視，應(yīng)用范圍不斷拓展，市場需求量越來越大。因其生長周期長，對生態(tài)環(huán)境要求高，供求矛盾日益突出，地下莖價格由2008年每公斤140元上升到2012年每公斤800元以上，4年翻了近6倍［3］，受利益驅(qū)動，人們對其無節(jié)制地采挖，已造成野生資源枯竭，因而人工栽培成為解決供需矛盾的主要途徑。常規(guī)采用根莖繁殖，但種源稀缺且用量大，難以滿足市場需求;種子繁殖具有繁殖系數(shù)大、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，但其休眠期長，發(fā)芽率低［4］，因此人工打破種子休眠，提高發(fā)芽率，縮短休眠周期才是目前解決七葉一枝花種苗奇缺的有效途徑。目前對七葉一枝花的研究主要集中在藥理活性等方面而對其種子萌發(fā)特性的研究尚未見報道。為此本文對七葉一枝花的種子采取變溫層積與激素處理相結(jié)合打破休眠并對其萌發(fā)溫度、培養(yǎng)基質(zhì)、光照等方面進行了系統(tǒng)研究，以期為七葉一枝花的繁殖及栽培提供技術(shù)參考，解決供求矛盾。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試種子采自井岡山區(qū)野生七葉一枝花。

1.2 研究方法

1.2.1 種子吸水

隨機選取100粒飽滿種子，用蒸餾水清洗干凈，吸干表水后用0.000 1 g電子天平稱重。然后放在20℃蒸餾水中浸泡，第一天每隔2 h稱重1次，第二天每隔6 h稱重1次，計算平均值。

1.2.2 萌發(fā)過程觀察

在種子萌發(fā)的不同階段用解剖鏡觀察其形態(tài)變化。

1.2.3 變溫層積與激素處理

種子采回后，去外果皮，用蒸餾水清洗干凈后涼干，用1 000倍多菌靈液浸泡消毒半小時，然后用細沙分層貯藏，在人工氣候箱內(nèi)進行“冷→熱→冷”變溫處理，冷處理溫度為5℃，熱處理為20℃。設(shè)置3種變溫處理，即“60 d冷→30 d熱→60 d冷”(T1)、“60 d冷→30 d熱→30 d冷”(T2)和“30 d冷→30 d熱→30 d冷”(T3)，置于人工氣候箱內(nèi)在20 ℃、周期性光照(1 500 lx，12 h·d－1)和以3 層濕潤濾紙為基質(zhì)的培養(yǎng)條件下進行種子萌發(fā)試驗;選取最佳的層積處理，采用不同濃度的GA3浸泡處理24 h，用蒸餾水作對照，進行萌發(fā)試驗，每隔5 d計算一次發(fā)芽數(shù)。每處理為30粒種子，3次重復。

1.2.4 溫度、基質(zhì)與光照處理

經(jīng)過變溫層積和GA3處理的種子，分別放在10℃、20℃、30℃條件下催芽試驗;在最合適的萌發(fā)溫度下設(shè)置珍珠巖、細砂、細黃土和濾紙4種基質(zhì)進行萌發(fā)試驗;選擇最合適的溫度和基質(zhì)進行光照(1 500 lx，12 h·d－1)與黑暗對照試驗。每處理為30粒種子，3次重復。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

種子著床后每天觀察正常萌發(fā)數(shù)，直至不再出現(xiàn)萌發(fā)種子為止，試驗過程每天補充蒸餾水以保持濾紙濕潤，以胚根從種孔伸出2 mm視為萌發(fā)［5］，計算種子萌發(fā)率。采用SPSS19.0和Excel2007對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析與比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子吸水特性

從圖1可以看出，前4 h內(nèi)為七葉一枝花種子的急劇吸水階段，此階段是由于細胞內(nèi)的親水物質(zhì)進行吸脹吸水;4 h之后是停止吸水階段，細胞利用已吸收的水分進行代謝作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)種子浸泡48 h，重量從 4.75 g 增加到 5.66 g，增加了19.16%，說明種子不存在種皮吸水障礙。雖然七葉一枝花種皮較硬，但種子具有種臍和種孔，并不影響種子對水分的吸收，說明種皮不是影響胚發(fā)育的原因，影響種子萌發(fā)的因素可能是種子內(nèi)源激素對胚發(fā)育的抑制而造成胚的生理后熟與形態(tài)后熟［7］。

圖1 七葉一枝花種子吸水曲線

2.2 種子萌發(fā)過程的觀察

七葉一枝花種子萌發(fā)過程(如圖2)大致可分為4個過程，即吸脹吸水、胚根伸出、胚根伸長、子葉出土。七葉一枝花種子在適宜的生長環(huán)境中，當胚生長發(fā)育到一定程度，胚根突破種皮，從胚珠珠孔伸出，當胚根長至1 cm左右時，種子基部開始膨大，形成一個小突起，胚根繼續(xù)生長，但胚芽并不繼續(xù)伸長，而是在種子內(nèi)休眠，此為二次休眠期。當胚芽抑制物被解除，二次休眠打破后，胚芽將種殼頂出土面，子葉出土后連同種殼脫落，種子萌發(fā)完成。

圖2 七葉一枝花種子萌發(fā)過程

2.3 變溫層積處理對種子萌發(fā)的影響

不同變溫層積處理方式對種子的萌發(fā)有不同的影響，其最佳處理方式為“60 d(5℃)→30 d(20℃)→60 d(5℃)”，即T1。T1處理在57 d種子就開始萌發(fā)，萌發(fā)進程僅需28 d，萌發(fā)率高達73.3%，種子萌發(fā)較整齊，長勢良好。從表1結(jié)果看，隨著低溫處理時間的延長，發(fā)芽率有所提高，但并沒有達到顯著性差異。但是隨著低溫處理時間的延長，七葉一枝花種子萌發(fā)時間提前，萌發(fā)過程明顯縮短，T1處理萌發(fā)過程僅需28 d，T2為35 d，T3為46 d，差異達顯著水平(p＜0.05)。試驗還發(fā)現(xiàn)無論冷處理時間長短，種胚都要經(jīng)過近兩個月以上的生理后熟和形態(tài)后熟的過程才能萌發(fā)。

表1 不同層積處理對種子萌發(fā)的影響

2.4 不同濃度GA3處理對種子萌發(fā)的影響

圖3 不同濃度的GA3處理下七葉一枝花種子逐日萌發(fā)曲線

將經(jīng)過變溫層積T1處理的種子采用不同濃度的GA3浸泡處理24 h，用清水作對照，種子萌發(fā)率見圖2和表2。由圖3可知，七葉一枝花種子在不同濃度的赤霉素下均能萌發(fā)，萌發(fā)率在100 mg·L－1以下時隨著濃度的增加而增加，100 mg·L－1以上時隨濃度的增加而降低。說明低濃度的GA3對七葉一枝花種子萌發(fā)有促進作用，當濃度過高時則對其萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用。

由表2可知，經(jīng)50～100 mg·L－1GA3處理的種子，其萌發(fā)率高于對照，其中100 mg·L－1GA3處理的種子萌發(fā)率高達90%，高出對照16.7%，差異顯著(P ＜0.05);經(jīng)250 ～1 000 mg·L－1GA3處理的種子，其萌發(fā)率則顯著(p＜0.05)低于對照，其中500 mg·L－1以上的GA3處理的種子萌發(fā)率僅為30%左右。不同處理的七葉一枝花種子開始萌發(fā)時間也不同，100 mg·L－1GA3處理組在第52 d開始萌發(fā)，比對照組提前 5d，差異顯著;50 mg·L－1、250 mg·L－1、1 000 mg·L－1處理組分別在第 54 d、56 d、60 d 開始萌發(fā)，與對照組差異不顯著;500 mg·L－1處理組在第63 d開始萌發(fā)，比對照推遲了5 d，差異顯著。

表2 不同濃度GA3對七葉一枝花種子萌發(fā)的影響

2.5 不同溫度對種子萌發(fā)的影響

將經(jīng)過 T1層積和100 mg·L－1GA3處理的種子，分別放在10℃、20℃、30℃條件下進行催芽試驗，結(jié)果如表3所示。七葉一枝花種子在10℃無萌發(fā)現(xiàn)象，在20℃時發(fā)芽率高達90%，30℃發(fā)芽率只有13.3%，各溫度處理間萌發(fā)率的差異均達到了顯著水平(p＜0.05)，說明七葉一枝花種子萌發(fā)對溫度要求嚴格。從以上結(jié)果看，七葉一枝花種子萌發(fā)最適宜溫度為20℃，萌發(fā)溫度范圍較窄，過高或過低對其萌發(fā)均不利。

表3 不同溫度對七葉一枝花種子萌發(fā)的影響

2.6 不同基質(zhì)對種子萌發(fā)的影響

不同基質(zhì)發(fā)芽試驗結(jié)果表明:細沙與其他3種基質(zhì)的發(fā)芽率存在顯著差異(p＜0.05)，其萌發(fā)率最高為96%;珍珠巖、細黃土和濾紙3種基質(zhì)萌發(fā)率分別為85%、86%和90%，差異不顯著。試驗表明，七葉一枝花種子萌發(fā)以細沙基質(zhì)為佳。

表4 不同基質(zhì)對七葉一枝花種子萌發(fā)的影響

2.7 光照對種子萌發(fā)的影響

采用1 500 lx每天12 h光照和黑暗對比試驗，結(jié)果如表5所示。光照條件與黑暗條件下七葉一枝花種子萌發(fā)率分別為96%和93%，無顯著性差異，說明七葉一枝花種子萌發(fā)不受光照的影響。

表5 光照對七葉一枝花種子萌發(fā)的影響

3 討論

3.1 變溫層積處理與激素對種子萌發(fā)的影響

休眠是植物經(jīng)過長期演化過程對環(huán)境與季節(jié)變化的適應(yīng)，就本身而言，它既是一個重要的生命過程，又是一個重要的生物學特性。由于七葉一枝花花期較短、果期較長，大量種子不能完全成熟［8］，有些果實雖然成熟了，但由于其生長在海拔相對較高的山區(qū)，為了適應(yīng)較為寒冷季節(jié)低溫的到來，種胚停止了發(fā)育，以度過不良的生長環(huán)境。本研究也發(fā)現(xiàn)七葉一枝花種子具有形態(tài)與生理深度休眠的特性，種子播種前采用變溫處理與激素處理相結(jié)合，可以在較短的時間內(nèi)打破休眠，促使種子萌發(fā)，比自然條件下提前10個月至1年出苗。

變溫層積處理可以打破植物休眠、促進胚的發(fā)育和種子萌發(fā)已經(jīng)在滇重樓等其他重樓屬植物種子上取得了較好的效果，陳疏影認為種子休眠的真正原因，可能是種子內(nèi)源激素含量較高而抑制種胚的發(fā)育，通過一段時間的低溫處理，抑制物被解除，促使細胞分裂和伸長的激素合成，胚才能生長［9］。本研究也發(fā)現(xiàn)，變溫層積可提前結(jié)束七葉一枝花種子的休眠期，促進其萌發(fā)，且變溫層積的關(guān)鍵在低溫處理時間長短與溫度的高低。陳疏影等認為較長的低溫環(huán)境是滇重樓種子休眠的重要原因，而在20℃環(huán)境下滇重樓種子萌發(fā)狀況良好，他建議提高變溫層積的溫度以打破休眠，縮短種子后熟期［9］，而本研究則發(fā)現(xiàn)隨低溫(5℃)處理時間的相對延長，七葉一枝花種子發(fā)芽率提高，本研究從側(cè)面證實了徐文娟關(guān)于滇重樓種子的研究結(jié)論，她認為低溫處理可促進種子內(nèi)GA3的合成［10］。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，無論何種處理條件下，種胚必須經(jīng)過2個月左右的生理后熟期才能萌發(fā)，其原因有待進一步深入研究。

GA3可軟化種胚周圍的組織，促進胚的生長，是解除種子休眠的關(guān)鍵內(nèi)源信號分子［11］。孟繁蘊等研究了滇重樓種子發(fā)育過程中內(nèi)源激素的變化，發(fā)現(xiàn)GA3可以將胚乳的貯藏物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可供胚細胞分裂與伸長的物質(zhì)，其含量的增加與其種胚發(fā)育的速度是一致，他認為GA3可誘導或抑制某些mRNA和蛋白質(zhì)的合成，從而促進胚乳中酶的合成，提高酶活性，加速物質(zhì)的合成與分解，打破種子休眠，促進胚的發(fā)育［12］。本研究表明GA3可促進七葉一枝花種子萌發(fā)，最佳濃度為100 mg·L－1，但并不是所有濃度對其萌發(fā)都有促進作用，當濃度過高(超過250 mg·L－1)則對其萌發(fā)有不同程度的抑制作用，這與馬紅媛等關(guān)于GA3對羊草種子萌發(fā)影響的研究結(jié)果類似［13］。

3.2 溫度、基質(zhì)與光照對種子萌發(fā)的影響

溫度是七葉一枝花種子萌發(fā)的重要因素，對其萌發(fā)影響達極顯著水平(p＜0.01)。七葉一枝花種子萌發(fā)在20℃條件下其萌發(fā)率可達90%，在30℃條件下其萌發(fā)率顯著降低，僅為13%，10℃條件下種子不萌發(fā)，由此可見七葉一枝花種子萌發(fā)對溫度適應(yīng)范圍狹窄。七葉一枝花種子在10月成熟［8］，此時已是深秋，溫度較低，不適合種子萌發(fā)，另外低溫可促進種子內(nèi)GA3的積累［10］，使種子完成形態(tài)與生理的后熟，等來年春天氣候適宜時萌發(fā)，避開不良的生長環(huán)境，這是植物對環(huán)境適應(yīng)性的表現(xiàn)。

陳志欣等以“勐海大葉茶”種子為材料，研究不同基質(zhì)對其萌發(fā)的影響，在不同的基質(zhì)中，‘勐海大葉茶’種子萌發(fā)率的變化不大［14］。本研究也得出相似的結(jié)論，七葉一枝花在珍珠巖、細黃土、濾紙、細沙中種子的萌發(fā)率依次升高，但差異并不顯著。這可能是因為七葉一枝花屬單子葉植物，其種子有胚乳，胚乳中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)完全能夠支持種子萌發(fā)，所以基質(zhì)對其影響不大。

光照對不同植物種子萌發(fā)的影響不同，鄭光華認為光照可促進大部分植物種子的萌發(fā)，抑制少部分植物種子萌發(fā)，尚有極少植物種子的萌發(fā)不受光照的影響［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，七葉一枝花種子萌發(fā)對光照的要求很低，在光照與黑暗條件下，其萌發(fā)率均能達到90%以上，但在光照條件下，其萌發(fā)率較黑暗整齊且胚軸生長狀況也比較好，與沈素貞等關(guān)于光照對短梗大參種子萌發(fā)的影響結(jié)論一致［16］，其原因可能是光照可促使胚軸快速合成葉綠素，從而進行光合作用，為其生長發(fā)育提供少量的能量。

4 結(jié)論

(1)七葉一枝花種子不存在吸水障礙，解剖鏡觀察其萌發(fā)過程發(fā)現(xiàn)種子具有二次休眠的特性。

(2)變溫層積處理過程中，隨著低溫處理時間的相對延長，萌發(fā)率有所提高。無論冷處理時間長短，種胚都要經(jīng)過近兩個月以上的生理后熟和形態(tài)后熟的過程才能萌發(fā)。

(3)低濃度的赤霉素可顯著促進七葉一枝花種子的萌發(fā)，高濃度則抑制其萌發(fā)，100 mg·L－1的赤霉素處理種子時萌發(fā)率最高。

(4)七葉一枝花萌發(fā)溫度范圍較窄，20℃為其萌發(fā)的最佳溫度，低于10℃不萌發(fā);基質(zhì)與光照對其萌發(fā)影響不大。

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