豬口蹄疫、豬瘟、高致病性藍耳病三種疫苗不同組合同時分點免疫的效果觀察

孟麗軍 ，楊曉玲 ，江文明 ，李云祝 ，孟坤武 ，胡安都

（1.四川省大竹縣動物疫病預防控制中心，四川 大竹 635100；2.四川省大竹縣畜牧食品局，四川 大竹 635100）

近年來，有很多地區(qū)針對豬瘟、豬口蹄疫、高致病性藍耳病這3種疫苗的免疫程序及聯(lián)合免疫效果進行了研究，各研究結(jié)果不盡一致。近期，四川大竹縣高致病性藍耳病的免疫抗體效價較低，是與同時注射不同疫苗有關(guān)，還是與先后注射不同疫苗的順序有關(guān)，尚缺乏試驗檢測的數(shù)據(jù)。為了準確評估3種疫苗聯(lián)合免疫后的效果及安全性，降低基層免疫工作強度和提高豬群的免疫抗體水平，本研究針對四川省大竹縣本地情況就3種疫苗的免疫程序進行研究，以優(yōu)化該縣的免疫程序。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選取大竹縣竹北鄉(xiāng)某豬場40～50日齡未經(jīng)任何疫苗免疫的仔豬133頭作為試驗豬，免疫前對試驗豬進行3種病毒（豬瘟、口蹄疫、藍耳病）的基礎(chǔ)抗體滴度測定，得出：高致病性藍耳病病毒抗體陰性，口蹄疫感染抗體陰性，豬瘟感染抗體陰性。3種病毒的免疫抗體滴度均低于1∶16，適合作為試驗對象。

1.2 試驗疫苗 豬O型口蹄疫滅活苗，生產(chǎn)批號：A110104J，生產(chǎn)廠家：中農(nóng)威特生物科技股份有限公司。政府采購豬瘟活疫苗（傳代細胞苗），生產(chǎn)批號：1030，生產(chǎn)廠家：廣東永順生物制藥有限公司。高致病性藍耳病滅活苗，生產(chǎn)批號：201012003，生產(chǎn)廠家：北京信得威特科技有限公司。

1.3 檢測試劑及檢測卡 檢測豬瘟、O型口蹄疫及高致病性藍耳病的抗體試劑盒和抗體快速金標檢測卡均購自深圳市某生物科技有限公司。

1.4 實驗儀器及器械 高速臺式離心機TGL-16B，微量振蕩器ZW-A，電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9070，酶標儀DNM-9602，單道/多道各種量程移液器，優(yōu)普超純水機UPT-II-5T，冰柜BCD-208；20mL金屬注射器，0.9號的獸用采血器，豬保定器，記號筆等。

1.5 試驗場地與飼養(yǎng)管理要求 試驗地設(shè)在大竹縣竹北鄉(xiāng)某豬場，附近無其他豬舍，各組單獨一圈，隔離飼養(yǎng)，飼喂相同飼料，整個試驗場地封閉管理，固定飼養(yǎng)人員，嚴格消毒，杜絕無關(guān)人員出入。

1.6 試驗分組 將133頭仔豬隨機分成7組：第1組18頭，注射豬O型口蹄疫滅活苗；第2組19頭，注射豬瘟活疫苗；第3組19頭，注射高致病性藍耳病滅活苗；第4組19頭，同時分點注射O型口蹄疫和豬瘟疫苗，間隔7d后再注射高致病性藍耳病疫苗；第5組19頭，同時分點注射口蹄疫和高致病性藍耳病疫苗，間隔7d后再注射豬瘟疫苗；第6組19頭，同時分點注射高致病性藍耳病和豬瘟疫苗，間隔7d后再注射口蹄疫疫苗；第7組20頭，同時分點注射口蹄疫、豬瘟及高致病性藍耳病疫苗。

1.7 免疫方法和部位 單種疫苗免疫，注射部位為左右頸部。2種疫苗和3種疫苗同時分點免疫，注射部位為左右頸部和腿部內(nèi)側(cè)。免疫有效劑量：口蹄疫疫苗1 mL、豬瘟疫苗1頭份、高致病性豬藍耳病滅活苗2mL。

1.8 臨床不良反應觀察 所有試驗豬在免疫注射后臨床觀察7～10d，主要觀察豬只精神狀況是否良好，采食是否正常，體溫有無升高，是否有其他嚴重不良反應，對異常的豬要作詳細記錄。

1.9 免疫抗體檢測 免疫后的14、21、28、35 d和42 d經(jīng)前腔靜脈采血，分離血清。采用間接ELISA法進行豬瘟、O型口蹄疫、高致病性藍耳病IgG抗體的間接ELISA測定，具體操作步驟依照試劑盒說明進行。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 樣品使用酶標儀于波長450 nm（630nm作為參比波長）下測定其吸光度（OD值），所得數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件的One-Way ANVOA方法進行統(tǒng)計學分析。

1.11 田間試驗 在以上3種疫苗同時分點免疫取得較好免疫效果和抗體合格率達標的情況下，隨后在大竹縣清河、永勝、歐家、李家、高穴等5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的多個散戶或者豬場進行田間試驗，并且在一免、二免、三免后用抗體快速金標檢測卡檢測其抗體合格率。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫副反應 對試驗豬免疫后96 h內(nèi)的精神、采食、體溫變化等免疫副反應情況進行逐頭觀察和記錄。試驗組1～6組（單免對照組及兩種疫苗聯(lián)合免疫組）免疫豬113頭，除第3組死亡1頭外，未出現(xiàn)精神不振、食欲下降、體溫升高等免疫副反應情況，未出現(xiàn)死亡情況。試驗7組免疫豬20頭，有1頭出現(xiàn)呼吸急促、精神不振、食欲下降、體溫偏高等一般免疫副反應，免疫副反應率為5%。

2.2 不同免疫程序口蹄疫抗體的產(chǎn)生情況 從表1和圖1可看出，各組抗體水平都在35d達到了最高值，且維持時間較長，在42d的時候還處于比較高的抗體水平。第5、7組抗體水平要稍高于其他組（P＜0.05），口蹄疫和藍耳病結(jié)合分點注射，其中包括3種疫苗聯(lián)合，對口蹄疫抗體水平的提高起到了促進作用。而其他組合對口蹄疫的抗體效價沒有較大的影響，和對照組單免口蹄疫的抗體水平保持一致。

表1 免疫豬口蹄疫血清IgG抗體間接ELISA檢測（xˉ±s）

圖1 免疫豬口蹄疫血清IgG抗體效價變化圖

2.3 不同免疫程序高致病性藍耳病抗體的產(chǎn)生情況

從表2和圖2可以看出，高致病性藍耳病抗體在免疫后35d達到較高的抗體水平，但是和豬瘟、口蹄疫抗體的OD值相比仍較低。第5組的抗體水平要高于其他組（P＜0.05），比單獨注射藍耳病疫苗的陽性率高，說明藍耳病疫苗及豬口蹄疫疫苗分點同時注射對藍耳病疫苗有效抗體的產(chǎn)生有積極的協(xié)同作用，并促進藍耳病抗體的產(chǎn)生。第6組的抗體水平明顯低于其他組（P＜0.05），說明豬瘟疫苗和高致病性藍耳病疫苗同時分點注射對藍耳病抗體的產(chǎn)生有一定的干擾作用。

表2 免疫豬藍耳病血清IgG抗體間接ELISA檢測（xˉ±s）

圖2 免疫豬藍耳病血清IgG抗體效價變化圖

2.4 不同免疫程序豬瘟抗體的產(chǎn)生情況 從表3和圖3可以看出，豬瘟抗體在免疫后的28d達到最高抗體水平，之后開始下降。第4、5組抗體水平和第2組對照組沒有明顯的差別（P＞0.05），說明豬瘟和口蹄疫聯(lián)合分點注射沒有互相干擾。第6、7組抗體水平較低，使豬瘟免疫抗體水平最高值推遲到接種后35d，說明藍耳病疫苗及豬瘟疫苗分點同時注射對豬瘟有效抗體的產(chǎn)生有干擾作用，并推遲豬瘟免疫抗體水平的升高。

2.5 不同免疫程序在免疫后35d的抗體合格率 采用ELISA方法，具體操作參照試劑盒說明書進行。判定標準：待檢血清450 nm（630 nm作參比波長）處的吸光值（OD值）大于陰性對照A值平均值的2.1倍，即判為陽性；如陰性對照孔OD值的平均值低于0.08時，則按照0.08計算。

表3 免疫豬豬瘟IgG抗體間接ELISA檢測（xˉ±s）

圖3 不同免疫程序豬瘟抗體變化圖

從各組的合格率結(jié)果分析（見表4），每組的合格率達到了國家規(guī)定的標準，豬瘟和口蹄疫都達到了較高的合格率，相比之下高致病性藍耳病抗體的合格率較低。從合格率看，第7組3種疫苗同時分點免疫達到了國家規(guī)定的標準，并且和單獨免疫及分兩次免疫相比，合格率沒有很大的差異。

表4 免疫后35d不同抗體的合格率

2.6 3種疫苗同時分點免疫（田間試驗）的抗體合格率及免疫副反應情況 田間試驗的試驗豬共592頭，全都按照3種疫苗同時分點注射的方式進行。其中有3頭出現(xiàn)了免疫副反應。在免疫后用抗體快速金標檢測卡進行檢測，其中對107頭進行首免后30d檢測；對102頭進行二免后30d檢測；對383頭進行三免后30d檢測。檢測方法按照說明書進行，用肉眼觀察檢測線和對照線的差別。檢測線顏色越深，抗體滴度越高，如果檢測線顏色很淺，比對照卡中1∶16顏色都還淺的時候說明抗體滴度不合格。

從圖4可以看出，首次免疫的檢測線顏色較淺，二免和三免的檢測線顏色逐步加深，說明抗體滴度隨著免疫次數(shù)的增多而增強。從表5可以看出，抗體合格率都達到了國家規(guī)定的標準，豬瘟和口蹄疫呈高位態(tài)勢。

3 討論

3.1 豬瘟活疫苗和高致病性藍耳病活疫苗的應用 本次研究，豬瘟活疫苗采用了1頭份劑量對仔豬進行了免疫，從結(jié)果可以看出，不同方式的免疫接種，其平均豬瘟抗體OD值均在28～35d達到合格水平。而當前在大竹縣實際生產(chǎn)中，不少散戶自行進行多頭份免疫，這種做法在實際生產(chǎn)中必要性不大。目前國內(nèi)不少學者均持有相同觀點。7個組高致病性藍耳病的抗體水平都低于豬瘟和口蹄疫的抗體水平，說明高致病性藍耳病活疫苗免疫一次的效果不是很好，必須要經(jīng)過加強免疫才能達到較高的抗體水平。這與冉智光等得出的結(jié)論相似。

圖4 3種疫苗聯(lián)合分點免疫（田間試驗）不同免疫次數(shù)的金標檢測卡所顯示的抗體滴度

表5 3種疫苗聯(lián)合分點免疫（田間試驗）的抗體合格率

3.2 兩種疫苗同時分點免疫 豬瘟和藍耳病疫苗同時分點免疫時，豬瘟抗體效價的產(chǎn)生出現(xiàn)了抑制和推遲，而在同時分點免疫的7d后又免疫口蹄疫苗，結(jié)果口蹄疫抗體值相對其他方式有所降低，高致病性藍耳病的抗體水平也受到了影響，華樹明、羅冬生等也得出了相同的研究結(jié)論，故這種免疫組合方式在實際生產(chǎn)中應盡量規(guī)避。同時分點免疫口蹄疫和藍耳病，結(jié)果藍耳病和口蹄疫的抗體值相對其他組增高，證明該兩種疫苗在進行同時分點免疫時，具有明顯的協(xié)同促進效應，這與當前多家類似研究的結(jié)果一致。在7d后免疫豬瘟，其抗體值和產(chǎn)生時間均不受影響。因此，根據(jù)本次試驗的研究結(jié)果，大竹縣豬場可采用第5組免疫方案。

3.3 3種疫苗同時分點免疫 3種疫苗同時分點免疫在實際生產(chǎn)中具有節(jié)省人工，降低生物安全風險，減少多次免疫所產(chǎn)生的應激等優(yōu)勢。本研究將豬瘟、豬口蹄疫、豬高致病性藍耳病3種疫苗同時分點免疫時，表現(xiàn)出5%的免疫副反應。這與馬睿麟等的研究結(jié)果存在差異，可能與本次試驗對象的個體差異及群體數(shù)目相對較小有關(guān)。田間試驗的試驗豬共592頭，有3頭出現(xiàn)了免疫副反應，表現(xiàn)出0.5%的免疫副反應，但還在免疫反應的正常范圍內(nèi)（2%～0.05%）?？偟恼f來，3種疫苗同時分點免疫的免疫副反應和單獨免疫及兩兩結(jié)合免疫的免疫副反應沒有明顯的差別。

3.4 免疫次數(shù)和抗體效價的關(guān)系 從田間試驗3種疫苗同時分點免疫各次免疫的抗體效價測定結(jié)果看，免疫次數(shù)和抗體效價成正比關(guān)系，加強免疫的抗體滴度明顯高于首免的抗體滴度，所以通過加強免疫可以提高抗體的滴度，提高免疫保護力。

4 結(jié)論

通過豬場試驗和田間試驗對抗體滴度的測定以及抗體合格率的統(tǒng)計表明，3種疫苗同時分點免疫的抗體滴度維持在較高水平，抗體合格率都達到了國家規(guī)定的標準，所以在保證安全性和提高免疫效果的前提下，為節(jié)省人力、財力，以及減少多次免疫引發(fā)的豬應激反應，特別是在散養(yǎng)戶和小型養(yǎng)豬場，可以推廣3種疫苗同時分點注射的免疫方式，以此辦法進行試點推廣，推廣結(jié)果有待我中心進一步作跟蹤研究。

致謝：本試驗得到了大竹縣畜牧食品局的大力支持和大竹縣動物疫病預防控制中心所有同志們的大力協(xié)助；另外，也得到了大竹縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所陳明、趙朝霞、李永川、王博等的大力幫助，在此一并致謝！

[1]王學瓊，普加權(quán).豬口蹄疫與豬瘟、豬肺疫雙聯(lián)苗同步免疫研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報，2008，23（1）：84-86.

[2]楊 慧，封 林，黎 強，等.豬口蹄疫和豬瘟疫苗同時注射免疫試驗技術(shù)報告[J].中國動物檢疫，2009，26（1）：38-41.

[3]李金海，張 東，鄧永強，等.同時免疫口蹄疫和高致病性藍耳病疫苗對免疫效果的影響[J].畜禽業(yè)，2008，（5）：33-34.

[4]馬睿麟，蔡金山，沈艷麗，等.豬瘟、口蹄疫、高致病性藍耳病等多種疫苗免疫試驗 [J].畜牧與獸醫(yī)，2010，42（10）：79-81.

[5]張長龍，嚴寶英，賈文孝，等.豬瘟、豬口蹄疫、高致病性豬藍耳病疫苗有效免疫試驗初探 [J].動物醫(yī)學進展，2009，（7）：101-103.

[6]朱善德，樊 莉，盧黎明，等.豬瘟、口蹄疫和藍耳病三種疫苗免疫程序比對試驗[J].試驗研究，2009，（4）：37-38.

[7]冉智光，楊澤林.農(nóng)村散養(yǎng)豬高致病性藍耳病豬瘟和口蹄疫免疫程序研究[A].第三屆豬病防控學術(shù)研討會會議論文集[C].2008：243-246.

[8]華樹明.豬口蹄疫、豬瘟、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征分點免疫注射效果觀察[J].獸醫(yī)導刊，2008，（4）：23-24.

[9]羅冬生，鄭姣妹，王琿，等.不同疫苗對豬瘟及豬口蹄疫抗體效價的影響[J].湖南畜牧獸醫(yī)，2009，（2）：17-19.

[10]曾存芳，屈康子，趙文舉，等.豬瘟疫苗（兔源）、豬O型口蹄疫疫苗、豬藍耳病疫苗有效免疫試驗報告[J].中國豬業(yè)，2008，（6）：36-40.

[11]李敏玲，王軍玲，鄭紅霞.豬瘟疫苗（兔源）、豬O型口蹄疫疫苗、豬藍耳病疫苗不同組合免疫的效果[J].畜禽業(yè)，2009，（1）：55-56.

[12]任宇斕，于厚軍，蔣文生，等，豬口蹄疫、豬瘟、高致病性豬藍耳病3種疫苗不同組合同時分點免疫效果觀察與分析[J].中國動物檢疫，2011，28（5）：67-71.