響應(yīng)面法優(yōu)化一株中度嗜鹽菌的培養(yǎng)條件

陳蔚青，李一飛，申屠超

(浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310015)

嗜鹽菌(Halophiles)是存在于海洋、鹽湖、鹽場(chǎng)以及腌制品等高鹽環(huán)境中的微生物，其種類(lèi)繁多，分布的范圍也較廣。根據(jù)其對(duì)鹽的嗜耐程度一般可分為弱嗜鹽菌、中度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌。嗜鹽菌具有特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理功能和代謝特性，大多數(shù)嗜鹽菌能通過(guò)迅速合成和降解糖、氨基酸等小分子溶質(zhì)，構(gòu)成滲透壓調(diào)節(jié)劑，幫助細(xì)胞從所處高鹽環(huán)境中獲取水分，并且穩(wěn)定和保護(hù)菌體內(nèi)酶的活性［1］。嗜鹽菌具有極端水解酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等分泌能力，因而其在食品工業(yè)、飼料業(yè)、生物及化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域有重要應(yīng)用前景，有望解決已有的水解酶在高鹽環(huán)境下往往達(dá)不到最大活性的難題［2-4］。響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法(response surface methodology，RSM)是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，可用來(lái)對(duì)受多個(gè)變量影響的響應(yīng)問(wèn)題進(jìn)行數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)分析，并可以將該響應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。近年來(lái)采用RSM對(duì)微生物培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化已有一些報(bào)道，并取得了較好的優(yōu)化結(jié)果［5-6］。本文擬利用RSM優(yōu)化一株自行篩選的中度嗜鹽菌sdc-3的培養(yǎng)條件，采用Plackett-Burman(P-B)設(shè)計(jì)法確定菌株生長(zhǎng)的主要影響因子，用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域，然后利用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Central composite design，CCD)及響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸，以期獲得嗜鹽菌sdc-3優(yōu)化的培養(yǎng)條件，從而為后續(xù)應(yīng)用研究提供技術(shù)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜鹽菌甘油保藏菌株sdc-3 浙江樹(shù)人大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏，該菌株從腌肉表面分離，屬中度嗜鹽菌;經(jīng)16S rDNA測(cè)序與序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與多株芽孢桿菌屬(Bacillus)和海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)菌株序列同源性為93%，具體分類(lèi)尚待進(jìn)一步鑒定［7］;研究發(fā)現(xiàn)其具有較高的羧甲基纖維素酶活性。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment design

培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基［8］、高氏一號(hào)培養(yǎng)基［9］、CZ培養(yǎng)基［10］、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［11］、Gibbons 培養(yǎng)基［12］、酪蛋白培養(yǎng)基［13］;NaCl 視需要添加。

YS-100雙目顯微鏡 日本Nikon公司;Vis-7220可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司;SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SKY-2102c恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司;移液槍Eppendorf Research;FD-2電加熱器 嘉興市欣欣儀器設(shè)備有限公司;HG-50高壓滅菌鍋 HIRAYAMA制造公司;FA2104電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-1FB超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)嗜鹽菌培養(yǎng)情況的比較 配制添加4%NaCl的6種培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、CZ培養(yǎng)基、Gibbons培養(yǎng)基、酪蛋白培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)，滅菌后按每個(gè)250mL搖瓶中100mL的裝液量加入，以2%接種量分別接入菌種，在35℃、p H7.5、120r/min條件下培養(yǎng)52h，期間定期測(cè)定培養(yǎng)液的OD600nm凈增值，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，比較不同培養(yǎng)基中嗜鹽菌生長(zhǎng)情況，選擇生長(zhǎng)情況較好的一個(gè)培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 耐鹽性實(shí)驗(yàn) 按1.2.1實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基后，分別配制不同鹽度的培養(yǎng)基，即:0%、2%、4%、5%、6%、8%、10%、12%，按每個(gè)250mL搖瓶中100mL的裝液量加入，以2%接種量加入菌種，在35℃、pH7.5、120r/min條件下培養(yǎng)2d，測(cè)OD600nm的凈增值，比較嗜鹽菌在不同鹽度下的生長(zhǎng)情況，選擇最佳生長(zhǎng)鹽度。同時(shí)采用菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)不同鹽度下菌體的存活率。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)法篩選嗜鹽菌培養(yǎng)重要影響因素 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果并參考相關(guān)文獻(xiàn)［14-16］，本實(shí)驗(yàn)選取6個(gè)因素作為研究對(duì)象(表1)，另外選擇3個(gè)虛擬項(xiàng)以考察誤差。每個(gè)因素均選取高、低兩個(gè)水平，運(yùn)用design expert 7.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出P-B實(shí)驗(yàn)組次為12組，以600nm時(shí)的吸光度凈增值為響應(yīng)值，運(yùn)用design expert 7.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，觀察方差分析中的顯著性和擬合度，比較各因素對(duì)嗜鹽菌生長(zhǎng)的影響。

1.2.3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) P-B實(shí)驗(yàn)找出三個(gè)顯著影響因素后，為使響應(yīng)面能更好地反映真實(shí)情況，進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最佳響應(yīng)區(qū)域。以P-B實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)分析得到的一次回歸模型方程及顯著因素的效應(yīng)值判斷最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的走向和步長(zhǎng)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。選取600nm時(shí)吸光度凈增值最大的組合。

1.2.3.3 中心組合(CCD)實(shí)驗(yàn) 依據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得出的嗜鹽菌最佳生長(zhǎng)區(qū)域后，運(yùn)用design expert 7.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)的組合表，以600nm時(shí)的吸光度凈增值為響應(yīng)值，中心點(diǎn)組合重復(fù)5次，共17次實(shí)驗(yàn)。將所得吸光度凈增值填入相應(yīng)組次，應(yīng)用軟件進(jìn)行分析，觀察方差分析中的顯著性及擬合度，并將結(jié)果建立三維響應(yīng)曲面，觀察中心點(diǎn)是否突出，最后可由軟件計(jì)算得出嗜鹽菌的最佳培養(yǎng)條件。

1.2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照軟件處理后所得的最佳培養(yǎng)條件配制培養(yǎng)基和設(shè)定培養(yǎng)條件，在此基礎(chǔ)上設(shè)置三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，比較所測(cè)得的OD600nm凈增值是否與預(yù)測(cè)值相近，若相近，則本次響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)成功，所得條件可信。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基的選擇

由圖1可見(jiàn)，該嗜鹽菌在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況差異較大，在LB培養(yǎng)基和酪蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況相對(duì)較好。酪蛋白培養(yǎng)基是嗜鹽菌培養(yǎng)常用培養(yǎng)基，但由于酪蛋白幾乎不溶于水，配制酪蛋白培養(yǎng)基時(shí)需先將酪蛋白溶于稀堿液并加熱方能溶解，且該培養(yǎng)基易產(chǎn)生沉淀，故為方便操作、減小后續(xù)實(shí)驗(yàn)中生物量測(cè)定時(shí)的誤差，實(shí)驗(yàn)選擇LB培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。根據(jù)圖1生長(zhǎng)曲線(xiàn)形態(tài)，培養(yǎng)時(shí)間可確定為48h。

圖1 sdc-3菌株在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth condition of strain sdc-3 in different media

2.2 耐鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由耐鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，sdc-3菌種在0%～10%鹽度區(qū)間內(nèi)生長(zhǎng)較好，超過(guò)10%鹽度有明顯下降趨勢(shì)。在0%和2%鹽度情況下該菌株生長(zhǎng)狀況與5%～6%鹽度下幾乎無(wú)異，推測(cè)因?yàn)樵摼晔菑碾缰破分泻Y選獲得，腌制品在腌制過(guò)程中是逐步失水，可能導(dǎo)致該菌種鹽度適應(yīng)范圍較廣。文獻(xiàn)中［17-20］對(duì)中度嗜鹽菌的定義大致為“中度嗜鹽菌是一類(lèi)能夠耐受0%～32%高鹽環(huán)境，在3%～15%最佳生長(zhǎng)的極端微生物類(lèi)群”，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。結(jié)合中度嗜鹽菌特性及本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇鹽度5%～6%為條件優(yōu)化的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)了不同鹽度下菌體的存活率，結(jié)果表明在0～10%鹽度下sdc-3菌株的菌體存活率在98%以上，不同鹽度間存活率無(wú)顯著性差異。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Design and result of Plackett-Burman experiment

圖2 sdc-3菌株在不同鹽度下的培養(yǎng)情況比較Fig.2 Comparison of growth condition of strain sdc-3 in different salinity

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果

2.3.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果 P-B實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，因素影響效果分析見(jiàn)表3。在95%置信區(qū)間下，C(鹽度)、D(初始pH)和F(培養(yǎng)溫度)為顯著影響因子。同時(shí)得到一次回歸模型方程:Y=1.21+0.074A+0.12B-0.39C+0.32D-0.14E+0.93 F，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9809，擬合很好，6個(gè)因子對(duì)響應(yīng)值的影響大小依次是:培養(yǎng)溫度＞鹽度＞初始pH＞裝液量＞酵母提取物＞胰蛋白胨。相較于培養(yǎng)基成分，嗜鹽菌對(duì)于溫度等培養(yǎng)條件更為敏感，這可能與單因素實(shí)驗(yàn)已優(yōu)化了培養(yǎng)基的基本組成有關(guān)。由上述一次回歸模型方程可知，A(胰蛋白胨)、B(酵母提取物)、E(裝液量)效應(yīng)值較小，在95%的置信區(qū)間內(nèi)對(duì)嗜鹽菌生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響?？紤]到若偏回歸系數(shù)為正值表明該因素起正效應(yīng)，應(yīng)取高水平;若系數(shù)為負(fù)值則表明該因素起負(fù)效應(yīng)，取低水平，因而根據(jù)A、B、E 系數(shù)(0.074、0.12、-0.14)取胰蛋白胨 10g/L、酵母提取物5g/L、裝液量70m L/250m L搖瓶。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素影響效果分析Table 3 Effects of Plackett-Burman experiment

2.3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)P-B實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，C(鹽度)、D(初始pH)和F(培養(yǎng)溫度)在95%的置信區(qū)間內(nèi)對(duì)嗜鹽菌生長(zhǎng)具有顯著影響。對(duì)C、D、F進(jìn)行最陡爬坡，由表4可知，最優(yōu)條件在第四項(xiàng)附近，因此以C(鹽度)濃度5%、D(初始 pH)8.0、F(培養(yǎng)溫度)33℃作為后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 4 Experimental design and results of steepest ascent

2.3.3 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果 根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得到的中心點(diǎn)對(duì)鹽度、初始pH和培養(yǎng)溫度進(jìn)行中心實(shí)驗(yàn)組合設(shè)計(jì)，為使擬合方程具有旋轉(zhuǎn)性和通用性，中心點(diǎn)重復(fù)5次。自變量水平及編碼見(jiàn)表5，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6。

通過(guò)design expert 7.0軟件分析，各個(gè)因子的偏回歸系數(shù)估計(jì)值及方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。

由此表可得到擬合的全變量編碼水平的二次回歸方程為:Y=3.30+0.18C-0.058D-0.043F+0.057CD+(7.250E-003)CF-0.046DF-0.18C2-0.11D2-0.20F2。

表5 中心組合實(shí)驗(yàn)的變量和水平Table 5 Code-level and values of central composite design

表6 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 The central composite design and the result

表7 中心組合實(shí)驗(yàn)的方差分析Table 7 The regression analysis of the central composite design experiment

由表7可知，模型(p值為＜0.0001)是非常顯著的，模型失擬項(xiàng)(Lack of Fit)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率，而失擬項(xiàng)p值為0.1188，大于0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著，模型選擇合適?；貧w系數(shù)R2=0.9902＞0.9，說(shuō)明模型相關(guān)度很好?？梢允褂迷撃Ｐ蛠?lái)分析響應(yīng)值的變化。

2.3.4 響應(yīng)面分析 為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量間的交換作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)design expert 7.0軟件繪制響應(yīng)面曲線(xiàn)圖進(jìn)行可視化分析，3組以菌體增長(zhǎng)量(OD600nm凈增值)為響應(yīng)值的趨勢(shì)圖見(jiàn)圖3～圖5。由圖可知，響應(yīng)值存在最大值，經(jīng)軟件分析計(jì)算，得到嗜鹽菌培養(yǎng)生物量預(yù)測(cè)值最大時(shí)的組分濃度及培養(yǎng)工藝條件:鹽度為5.48%，初始pH為7.94，培養(yǎng)溫度為32.83℃，預(yù)測(cè)值OD600nm凈增值為3.352。

從圖像上也可看出，中心紅的區(qū)域越趨近于中心，區(qū)域俯視圖形越趨近于橢圓形，則表明兩變量間交互作用越顯著，越近于圓形則相反。

圖3 鹽度與初始pH交互作用曲面圖Fig.3 Response surface of interaction for salinity and initial pH

圖4 鹽度與培養(yǎng)溫度交互作用曲面圖Fig.4 Response surface of interaction for salinity and culture temperature

圖5 初始pH與培養(yǎng)溫度交互作用曲面圖Fig.5 Response surface of interaction for initial pH and culture temperature

2.3.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。考慮到實(shí)際操作的便利，將部分優(yōu)化參數(shù)修正為pH7.9、培養(yǎng)溫度32.8℃，其余條件不變。經(jīng)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得菌體增長(zhǎng)量(OD600nm凈增值)為3.349±0.021，與理論預(yù)測(cè)值3.352非常接近，表明該模型是合理有效的，能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際的菌體生長(zhǎng)情況。

3 結(jié)論

本項(xiàng)目研究了一株篩選自腌肉制品表面中度嗜鹽菌的優(yōu)化培養(yǎng)條件。單因素實(shí)驗(yàn)確定LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并確定合適鹽度區(qū)間基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)影響嗜鹽菌生長(zhǎng)的重要培養(yǎng)基成分和工藝條件進(jìn)行篩選，確定主要影響因子為鹽度、初始pH和培養(yǎng)溫度;再用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域;最后用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，確定了主要影響因子的取值。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 54.8g/L;培養(yǎng)工藝條件為初始 p H7.9、培養(yǎng)溫度 32.8℃、裝液量70mL/250mL搖瓶、搖床轉(zhuǎn)速120r/min。在此培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2d后，嗜鹽菌的密度(OD600nm凈增值)達(dá)3.349±0.021，較優(yōu)化前提高了13%。且與預(yù)測(cè)值擬合良好，說(shuō)明有實(shí)際指導(dǎo)作用。

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