18種老化指示物質(zhì)在啤酒發(fā)酵過程中的變化研究

尹 花，田玉紅，郝俊光，董建軍

(啤酒生物發(fā)酵工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌)，青島啤酒股份有限公司，山東青島266061)

啤酒新鮮度是消費(fèi)者非常關(guān)注的品質(zhì)指標(biāo)，也是各大啤酒公司關(guān)注的關(guān)鍵指標(biāo)。由于中國啤酒的釀造普遍使用高濃高輔(麥汁濃度高，高輔料比)技術(shù)，酒液日趨淡爽，造成酒基對(duì)老化風(fēng)味的掩蓋效果下降，使得新鮮度問題變得更為突出。對(duì)啤酒老化的集中研究可追溯于上世紀(jì)60年代，Vanderhaegen［1］等對(duì)目前已確認(rèn)的與啤酒老化相關(guān)的物質(zhì)進(jìn)行了匯總。目前，人們普遍接受的老化機(jī)理包括脂質(zhì)氧化［2］、氨基酸降解［3-4］、高級(jí)醇氧化、Maillard 反應(yīng)［5］、酯化、內(nèi)酯化［6］等。通常情況下老化物質(zhì)是低于其閾值水平的，但不同老化物質(zhì)共同作用會(huì)導(dǎo)致老化味的產(chǎn)生。本文將在檢老化物質(zhì)定義為老化指示劑，這些物質(zhì)含量的變化與老化風(fēng)味的強(qiáng)弱有一定的關(guān)聯(lián)，在一定意義上可以指示啤酒老化的程度。在檢物質(zhì)可以根據(jù)老化機(jī)理和指示作用的不同，進(jìn)一步分為氧負(fù)荷指示劑、熱負(fù)荷指示劑和脂質(zhì)氧化指示劑，用于指示在釀造過程中所受到的氧、熱情況以及原料新鮮度對(duì)釀造過程的影響。以往對(duì)啤酒新鮮度的研究主要集中于老化物質(zhì)檢測方法的開發(fā)和對(duì)成品啤酒貯存過程的研究［1，7-8］，對(duì)釀造過程老化物質(zhì)變化的研究報(bào)道較少。隨著研究的深入，將研究過程前移，考察釀造過程中相關(guān)老化物質(zhì)的變化情況及影響因素是國內(nèi)外新鮮度調(diào)控工作的主要研發(fā)方向。針對(duì)目前釀造過程的報(bào)道主要是基于Ale啤酒的研究［9-10］，而國內(nèi)Lager酵母釀造淡爽型啤酒的過程研究尚待進(jìn)行的現(xiàn)狀，本研究選擇代表不同指示作用的18種老化物質(zhì)為研究對(duì)象，在建立SPMEGCMS 檢測方法［7-8，11-12］的基礎(chǔ)上，對(duì)其在釀造過程的變化趨勢進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、戊醛、己醛、糠醛、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、反-2-壬烯醛、糠基乙醚、乙酰呋喃、5-甲基糠醛、苯甲醛、煙酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、γ-壬內(nèi)酯、大馬烯酮 美國Sigma公司;乙醇 色譜純，德國Merck公司;超純水≥18.2MΩ。

Milli-Q plus純水儀 德國Millipore公司;固相微萃取自動(dòng)進(jìn)樣器 瑞士CTC公司;65μm PDMSDVB、65μm DVB/Carboxen/PDMS固相微萃取纖維美國 Supelco公司;Clarus600 GC-MS 美國PerkinElmer公司;DB-5MS(60m ×250μm ×0.25μm)色譜柱 美國Agilent公司。

1.2 測定方法

1.2.1 老化醛的檢測方法［8，11］啤酒釀造過程樣品的取樣點(diǎn)分別為:冷麥汁、滿罐、主酵、后熟、冷貯、成品。

2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、戊醛、己醛、糠醛、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、反-2-壬烯醛的檢測使用SPME-GCMS柱上衍生技術(shù)。檢測步驟如下:a.啤酒排氣，發(fā)酵液和麥汁過濾。在20mL頂空瓶中加2g NaCl。b.取5mL樣品到20mL頂空瓶，添加50μL內(nèi)標(biāo)物質(zhì)對(duì)氟苯甲醛(原液稀釋105倍)，旋緊瓶口。c.將65μm PDMS-DVB固相微萃取纖維插入裝有10mL、60mg/L O-(2，3，4，5，6-五氟芐基)羥胺(PFBOA)的頂空瓶中，以頂空方式50℃衍生15min。d.將萃取纖維再放入待測樣品頂空瓶中，以頂空方式50℃萃取待測物質(zhì)45min。e.上機(jī)檢測。GC條件:色譜柱 DB-5ms 60m ×320μm ×0.25μm。載氣為氦氣，流速1mL/min，進(jìn)樣口溫度250℃，無分流進(jìn)樣。程序升溫:40℃保溫2min;以10℃/min升到140℃;以7℃/min升到250℃;250℃保溫3min。MS條件:電子轟擊(EI)離子源，電子能量70eV;GC-MS接口溫度250℃;離子源溫度230℃;四極桿溫度150℃;掃描范圍50～550amu。羰基化合物的PFBOA衍生物的定性采用質(zhì)譜全掃描方式，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定性，定量采用選擇離子(61、181m/z)掃描方式。f.物質(zhì)的定量采用以啤酒為基體的外標(biāo)系列曲線法。

1.2.2 非醛類老化指示劑的集約化檢測方法 糠基乙醚、乙酰呋喃、5-甲基糠醛、苯甲醛、煙酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、γ-壬內(nèi)酯、大馬烯酮均為代表不同老化反應(yīng)途徑的老化指示劑，為區(qū)別于老化醛的衍生檢測技術(shù)，將這些物質(zhì)的檢測方法稱為集約化老化測定方法。檢測步驟如下:a、b步驟同1.2.1步驟 a、b。c.將 65μm DVB/CARBOXEN/PDMS 固相微萃取纖維插入待測樣品瓶中，以頂空方式50℃萃取40min。d.上機(jī)檢測。GC條件:色譜柱DB-5ms 60m×320μm×0.25μm 載氣為氦氣，流速1.5mL/min。進(jìn)樣口溫度250℃。無分流進(jìn)樣。程序升溫:40℃保溫2min;以 3℃/min升到 130℃;以 45℃/min升到250℃;250℃保溫2min。MS條件:電子轟擊(EI)離子源，電子能量70eV;GC-MS接口溫度250℃;離子源溫度230℃;四極桿溫度 150℃;掃描范圍 35～200amu，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于定性;SIM模式用于物質(zhì)的定量，不同物質(zhì)的定量離子不同。e.物質(zhì)的定量方法同1.2.1 f。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀造過程中老化醛類的變化趨勢

跟蹤工廠的釀造過程，分析冷麥汁、滿罐、主酵、后熟、冷貯、成品酒中的老化醛類物質(zhì)的含量。釀造過程為:13°P麥汁，滿罐時(shí)添加酵母，酵母添加量達(dá)2 ×107/mL，9.5℃主酵 110h，12℃后熟 13d，-1.0℃冷貯10d。冷貯酒經(jīng)稀釋后得到8°P成品酒，根據(jù)稀釋倍數(shù)進(jìn)行相應(yīng)換算。冷麥汁和滿罐樣品的老化醛對(duì)比見圖1，發(fā)酵過程的老化醛類變化見圖2。

圖1 冷麥汁和滿罐樣品中老化醛的含量差異Fig.1 Difference of aging aldehyde in cold wort and full tank sample

Strecker醛是氨基酸降解的產(chǎn)物，通常作為貯存過程氧負(fù)荷指示劑，其可在麥芽醅焦、糖化、麥汁煮沸、殺菌、貯存過程中形成。在成品啤酒中，Strecker醛類也可以通過高級(jí)醇氧化產(chǎn)生。由圖1可知，與麥汁相比，滿罐時(shí)樣品中所有醛類降到非常低的水平。其中，Strecker醛中的2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛和苯乙醛分別由75.61、33.63、146.30、49.37、133.57μg/L 下降至滿罐時(shí)的3.88、1.83、8.44、1.85、3.71μg/L。

反-2-壬烯醛、己醛、戊醛是不飽和脂肪酸降解的產(chǎn)物，通常作為原料新鮮度的指示劑，在啤酒的貯存過程中這些醛類會(huì)升高。不飽和脂肪酸及其中間產(chǎn)物的氧化分為酶促氧化和非酶促氧化，即不飽和脂肪酸的氧化受到脂肪酶、脂肪氧合酶(LOX)、過氧化物酶等的作用，也會(huì)發(fā)生受溫度和光影響的自氧

圖2 發(fā)酵過程中老化醛的變化趨勢Fig.2 Variation of aldehyde in fermentation process

2.2 釀造過程中集約化方法檢測的老化指示物質(zhì)的變化趨勢

同一個(gè)釀造過程中集約化方法檢測的老化指示物質(zhì)的變化趨勢見圖3。

圖3(a)顯示，乙酸苯乙酯在發(fā)酵過程中大幅增加，源自發(fā)酵過程中乙酸和苯乙醇的大幅增加，二者反應(yīng)生成大量的乙酸苯乙酯。乙酸苯乙酯為乙酸酯類化合物，具有水果香氣，是新鮮啤酒的正面風(fēng)味。在發(fā)酵過程中，由滿罐時(shí)的10.9μg/L大幅增至522.6μg/L，在隨后的冷貯至成品過程中略有下降，由冷貯酒中的 527.9μg/L下降至成品酒中的430.3μg/L。

圖3 發(fā)酵過程中集約化方法檢測的老化指示物質(zhì)的變化趨勢Fig.3 Variation of compouds in centralized detection method in fermentation process

γ-壬內(nèi)酯為內(nèi)酯類化合物，在發(fā)酵過程中亦有較大的增高(圖3(b))。主酵結(jié)束后，由冷麥汁中的3.3μg/L增長至27.1μg/L，其增長是酵母代謝脂肪酸的結(jié)果。γ-壬內(nèi)酯本身是椰子味，不是不愉快的味道，但其甜味降低了淡爽啤酒的新鮮感，從而被認(rèn)為是一種老化指示物質(zhì)。此外，γ-壬內(nèi)酯與反-2-壬烯醛的老化協(xié)同作用［6］，將增加啤酒的老化味。大馬烯酮在發(fā)酵過程中小幅增加，由0.5μg/L升至1μg/L。該物質(zhì)是由類胡蘿卜素衍生來的一類羰基化合物中的一種，呈水果香味，其在啤酒貯存過程中會(huì)上升［16］。

苯甲醛和5-甲基糠醛也是醛類化合物，跟其它醛類物質(zhì)一樣，在發(fā)酵初期因酵母還原而含量下降(圖3(c))。在包裝形成成品過程中，高溫殺菌造成5-甲基糠醛有較大幅度的上升。

糠基乙醚、乙酰呋喃及苯乙酸乙酯(圖3(d)～圖3(e))在發(fā)酵過程中含量略有波動(dòng)，變化趨勢不明顯。煙酸乙酯含量略有上升?？坊颐炎陨沓嗜軇┪叮?7］，實(shí)驗(yàn)證實(shí)酵母對(duì)糠基乙醚無轉(zhuǎn)化能力，即在成品酒中添加酵母將極大地改善紙板味(反-2-壬烯醛)等老化味，但對(duì)糠基乙醚的溶劑味沒有改善［18］。煙酸乙酯和乙酸乙酯同屬乙酯類，在發(fā)酵過程中含量不大，但會(huì)在成品啤酒貯存過程中因多量乙醇的存在而明顯升高［1］。乙酰呋喃作為麥德拉反應(yīng)產(chǎn)物，其在啤酒貯存過程中逐漸上升，與啤酒所受熱負(fù)荷直接相關(guān)，是啤酒的又一熱負(fù)荷指標(biāo)。但由于含量較低，在釀造過程的變化趨勢不明顯。

綜上所述，在啤酒發(fā)酵過程，既是醛類物質(zhì)被酵母大量還原的過程，也是乙酸苯乙酯、大馬烯酮、γ-壬內(nèi)酯等其它啤酒老化指示風(fēng)味物質(zhì)的生成過程。酵母還原醛類的能力與菌種特性有關(guān)，在大生產(chǎn)菌株一定的情況下，酵母的活力和生理狀態(tài)等直接影響到其還原醛類的能力，并決定成品啤酒的氧化-還原勢。筆者認(rèn)為，在啤酒的新鮮度調(diào)控中，降低氧負(fù)荷、熱負(fù)荷、過渡離子含量的同時(shí)，酵母的管理是又一調(diào)控核心。影響酵母活力的操作，都將影響到酵母的還原能力、產(chǎn)生內(nèi)源抗氧化劑的能力以及酵母生成醇酯風(fēng)味的能力。值得注意的是，如果酵母管理不當(dāng)，甚至?xí)斐山湍缸匀?，從而?huì)因釋放鐵、銅離子等促氧化因子和脂肪酸等老化底物，加劇啤酒的老化。

3 結(jié)論

本研究利用本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的GC-MS檢測方法，跟蹤了大生產(chǎn)中18種與老化相關(guān)物質(zhì)的變化過程，明確了其在釀造過程的變化趨勢。結(jié)果表明，酵母具有較高的還原性，麥汁中的老化醛類物質(zhì)在發(fā)酵初期即被大幅還原，發(fā)酵過程幾乎不變，酵母的菌種活力對(duì)成品酒中的醛類物質(zhì)的含量分布起到?jīng)Q定性作用。作為新鮮啤酒的代表風(fēng)味物質(zhì)乙酸苯乙酯，在發(fā)酵過程中大量生成;γ-壬內(nèi)酯、大馬烯酮是酵母代謝的產(chǎn)物，在發(fā)酵過程中亦有較大幅度的增加;而糠基乙醚等其它在檢物質(zhì)的變化無明顯規(guī)律。本研究識(shí)別出酵母對(duì)啤酒老化指標(biāo)的重要影響，明確了加強(qiáng)酵母管理的重要性，為大生產(chǎn)過程中新鮮度的調(diào)控提供了有力的支持。

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