出口濃縮果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離及相關(guān)生物學(xué)特性的研究

張宇霞，李 儒

(甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，甘肅蘭州730020)

脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus)，俗稱耐熱菌、嗜酸耐熱菌、耐熱耐酸菌等，Cemy等首次從腐敗的濃縮果汁中分離出一株含ω脂環(huán)酸的芽孢桿菌，并且證明該菌是造成巴氏滅菌果汁腐敗的主要原因之一［1］。Wisotzkey 等人［2］根據(jù)其堿基對(duì)的含量、耐酸與耐熱的特性、16S rDNA序列特性以及細(xì)胞膜特有的ω環(huán)狀脂環(huán)酸，于1992年首次將其從芽孢桿菌屬里分離出來，形成一個(gè)新屬，稱為脂環(huán)酸芽孢桿菌屬。目前，該菌屬包括17個(gè)已知種:A.acidocaldarius，A.acidoterrestris，A.acidiphilus，A.hesperidum，A.sendaiensis，A.vulcanalis，A.tolerans，A.disulfidooxidans，A.cycloheptanicus，A.herbarius，A.pomorum，A.contaminans，A.fastidiosus，A.kakegawensis，A.macrosporangiidus，A.Sacchari，A.shizuokensis;另外還有2個(gè)亞種:A.acidocaldarius subsp.Aidocaldarius和A.acidocaldarius subsp.Rittmannii［3］。大多數(shù)產(chǎn)芽孢細(xì)菌不能在果汁以及其它pH＜4.0的酸性環(huán)境中生長繁殖［4］，對(duì)酸性食品的殺菌多采用85～95℃巴氏殺菌就能收到了良好的效果。然而，高溫瞬時(shí)殺菌不能消除的蘋果濃縮汁產(chǎn)品中，抗逆性極強(qiáng)的脂環(huán)酸芽孢桿菌，這將嚴(yán)重影響著蘋果濃縮汁產(chǎn)品的品質(zhì)。中國是蘋果第一大生產(chǎn)國，濃縮蘋果汁也大量出口，為了提升濃縮蘋果汁的品質(zhì)，就要對(duì)其加工過程中脂環(huán)酸芽孢桿菌的污染和生長繁殖進(jìn)行有效地控制，這就必須弄清楚這些脂環(huán)酸芽孢桿菌的類型、來源和生理生長特性等，以便采取針對(duì)性的措施。截至目前為止，我國對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌屬的研究尚處于初步階段。因此，在我國開展該屬新菌種的開發(fā)、鑒定，地域分布特性及源于果汁的新菌株的分離鑒定及其特性研究，對(duì)有效控制其危害具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究將對(duì)濃縮蘋果汁生產(chǎn)線上的洗果水、冷凝水、蘋果清汁、蘋果濃縮汁等樣品中的脂環(huán)酸芽孢桿菌進(jìn)行分離、純化，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以及考察脂環(huán)酸芽孢桿菌在生產(chǎn)線上的分布，以便為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)材料，為生產(chǎn)中脂環(huán)酸芽孢桿菌的控制提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Alicyclobacillus acidoterrestris(ATCC 49025)、Alicyclobacillus cycloheptanicus(ATCC 49029)、A.acidocaldarius(ATCC 27009) 美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC);蘋果濃縮清汁(pH3.5～4.5、可溶性固形物含量為(71±1)°Brix) 甘肅省內(nèi)各果汁生產(chǎn)企業(yè);洗果水、浮洗水、沉淀池水 甘肅省內(nèi)各果汁生產(chǎn)企業(yè)。

B6200型電熱恒溫培養(yǎng)箱 德國memmert公司;超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司;臺(tái)式電子天平德國賽多利斯公司;紫外分光光度計(jì) 美國PE公司;高壓蒸氣滅菌器 MLS3570，日本三洋公司;負(fù)壓泵 美國GAST公司;杯式過濾除菌裝置 上海信步科技有限公司;酸度計(jì) 德國賽多利斯公司;恒溫振蕩培養(yǎng)箱 SHA-C，常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離培養(yǎng)

1.2.1.1 分離培養(yǎng)基的制備 按ATCC提供的1656 BAM-SM培養(yǎng)基配方并添加金屬離子溶液配制成分離培養(yǎng)基。CaCl2·2H2O 0.25g、MgSO4·7H2O 0.5g、(NH4)2SO40.2g、KH2PO43.0g、Yeast extract 6g、微量金屬溶液 1mL(CaCl2·2H2O 0.66g，ZnSO4·7H2O 0.18g，CuSO4·5H2O 0.16g，MnSO4·4H2O 0.15g，CoCl2·6H2O 0.18g，H3BO30.10g，Na2MoO4·2H20 0.30g，分別溶于1L滅菌蒸餾水)，加入1000mL滅菌蒸餾水，充分?jǐn)嚢枞芙夂笥肏2SO4調(diào)節(jié)pH至4.0，121℃高壓滅菌15min，即為1656 BAM-SM液體培養(yǎng)基。若制1656 BAM-SM瓊脂平板，先制備雙倍液體培養(yǎng)基(即同溶液體積中各成分加倍，調(diào)p H4.0)和等體積的4%蒸餾水瓊脂，然后為了防止瓊脂被酸化將兩者分別121℃高壓滅菌15min，在無菌條件下將保溫至50℃的雙倍液體培養(yǎng)基和4%蒸餾水瓊脂等體積混合，調(diào)pH至4.0后傾注平板，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 樣品來源及采集 樣品采自濃縮蘋果汁生產(chǎn)企業(yè)的濃縮蘋果汁成品、濃縮蘋果汁生產(chǎn)中最可能被脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的主要生產(chǎn)工段，主要包括車間生產(chǎn)用水和設(shè)備清洗用水，比如洗果水、浮洗機(jī)水、沉淀池水等，無菌取樣后立即送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.3 脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離 濃縮蘋果汁脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離參照文獻(xiàn)［5］的方法，用無菌吸管吸取10mL蘋果汁于90mL無菌蒸餾水的三角燒瓶中稀釋混勻，然后置于(80±1)℃的恒溫水浴箱內(nèi)處理13min，然后迅速置于冰水浴中冷卻至室溫。冷卻后在無菌條件下使處理液通過裝有孔徑為0.45μm濾膜的過濾器進(jìn)行抽濾，抽濾完畢后用無菌鑷子將濾膜取下，貼于分離培養(yǎng)基平板上，45℃培養(yǎng)3～5d，待濾膜上長出明顯菌落后直接從濾膜上挑取菌落，轉(zhuǎn)入斜面培養(yǎng)，經(jīng)過進(jìn)一步分離純化后得到純培養(yǎng)的菌株。洗果水、浮洗機(jī)水、沉淀池水等生產(chǎn)用水脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離，用無菌吸管吸取30mL(雜質(zhì)較多時(shí)采用1000r/min低速離心吸取上清)于70mL無菌水的三角燒瓶中稀釋混勻，其余步驟同濃縮蘋果汁脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離。將分離純化后的菌株-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脂環(huán)酸芽孢桿菌的生物學(xué)特性觀察

1.2.2.1 脂環(huán)酸芽孢桿菌的篩選 耐酸特性鑒定實(shí)驗(yàn):將濃縮蘋果汁和生產(chǎn)用水分離得到的純培養(yǎng)菌株劃線接種于LB平板培養(yǎng)基(pH7.0)，45℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，保留不能在LB平板上生長的菌落［6］。

耐熱特性鑒定實(shí)驗(yàn):將濃縮蘋果汁和生產(chǎn)用水分離得到的純培養(yǎng)菌株接種于10mL無菌水制成菌懸液，于80℃溫度下熱休克處理13min，再采用涂布法接種于1656 BAM-SM瓊脂平板培養(yǎng)24h，保留可以生長的菌落［5，7-8］。

1.2.2.2 脂環(huán)酸芽孢桿菌的細(xì)胞形態(tài)及菌落特征觀察 對(duì)經(jīng)過耐酸和耐熱特性檢驗(yàn)的菌株進(jìn)行細(xì)菌和菌落形態(tài)的初步觀察。

a.革蘭氏染色:選取培養(yǎng)24h內(nèi)斜面新鮮菌進(jìn)行革蘭氏染色處理，處理后進(jìn)行顯微鏡觀察其細(xì)菌形態(tài)［9］。

b.芽孢染色:選取培養(yǎng)24～48h斜面新鮮菌進(jìn)行芽孢染色處理，處理后進(jìn)行顯微鏡觀察其芽孢形態(tài)［9］。

c.菌落特征:將標(biāo)準(zhǔn)菌株Alicyclobacillus acidoterrestris(ATCC 49025)、Alicyclobacillus cycloheptanicus(ATCC 49029)和經(jīng)過耐酸和耐熱特性以及革蘭氏染色和芽孢染色檢驗(yàn)的分離菌株分別接種于1656 BAM-SM瓊脂平板培養(yǎng)24～72h，觀察各菌落在培養(yǎng)基上的顏色、形狀、大小等菌落形態(tài)。

1.2.2.3 生長條件實(shí)驗(yàn) p H的確定:采用1mol/L H2SO4和1mol/L NaOH調(diào)節(jié)1656 BAM-SM固體培養(yǎng)基的 p H 分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，將標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株分別接種于不同p H的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～5d觀察其生長情況，初步確定菌株生長的pH，再將其精確到0.1，每個(gè)酸度重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。將菌株接種于微調(diào)后的不同pH培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～5d觀察其生長情況，最終確定各菌適宜生長的p H。

生長溫度的確定:將標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株分別接種于1656 BAM-SM固體培養(yǎng)基上，分別于20、30、40、50、60和70℃培養(yǎng)2～5d，根據(jù)初測結(jié)果溫度調(diào)整各菌的生長溫度范圍，精確到1℃，將各菌株接種于培養(yǎng)基上置于微調(diào)后的不同溫度下，培養(yǎng)2～5d，觀察各菌生長情況，確定各菌適宜的生長溫度。

1.2.2.4 生理生化反應(yīng)特征 過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)、明膠液化、V-P實(shí)驗(yàn)、淀粉水解、N源利用實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、脲酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)等均參照文獻(xiàn)［9］的方法進(jìn)行，為了保證脂環(huán)酸芽孢桿菌生長所需要的酸性條件，一般采用蘋果酸酸化的培養(yǎng)基進(jìn)行以上生理生化實(shí)驗(yàn)，同時(shí)利用生物梅里埃的API 50 CH生化反應(yīng)試劑條進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)菌株及分離菌株生長曲線的確定 分別將標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株的45℃、72h單個(gè)培養(yǎng)菌落接入100mL 1656 BAM-SM液體培養(yǎng)基中，于45℃溫度下培養(yǎng)，分別在4、8、17、24、32、48、55、72、96h 取液體培養(yǎng)物10mL，測定菌體的吸光值，并同時(shí)將該液體培養(yǎng)物1mL經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于1656 BAM-SM固體培養(yǎng)基上，45℃、72h條件下進(jìn)行培養(yǎng)，然后計(jì)數(shù)，分別建立標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株在45℃溫度下的吸光值與培養(yǎng)時(shí)間以及吸光值與菌濃度之間的關(guān)系曲線。

表1 各菌株菌落形態(tài)觀察結(jié)果Table 1 Observation results of colony morphology of different

表2 各菌株細(xì)菌形態(tài)觀察結(jié)果Table 2 Observation results of cellular morphology of different strains

2 結(jié)果與分析

2.1 脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離純化及耐酸耐熱性檢驗(yàn)

通過對(duì)甘肅省內(nèi)濃縮蘋果汁生產(chǎn)企業(yè)的濃縮蘋果汁成品以及濃縮蘋果汁生產(chǎn)中最可能被脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的主要生產(chǎn)工段，主要包括車間生產(chǎn)用水和設(shè)備清洗用水，比如洗果水、浮洗機(jī)水、沉淀池水等進(jìn)行無菌取樣，共采集144個(gè)樣品，經(jīng)過分離、篩選和純化，共得到59株分離菌株。將分離菌株經(jīng)過80℃溫度下熱休克處理13min，均能很好地生長，表明其有很好的耐熱性;在1656 BAM-SM培養(yǎng)基上生長良好，但在LB培養(yǎng)基上均不能生長，證明其均有嗜酸性。因此可以初步證明本實(shí)驗(yàn)分離到的59株菌為嗜酸耐熱且產(chǎn)生芽孢桿菌。

2.2 脂環(huán)酸芽孢桿菌的生物學(xué)特性

2.2.1 脂環(huán)酸芽孢桿菌細(xì)胞形態(tài)及菌落形態(tài)觀察按1.2.1方法分離培養(yǎng)可以得到大量的耐熱耐酸菌，這些耐熱耐酸菌用通常的細(xì)菌檢測方法難以檢出，在45℃條件下常需要2～5d才可以形成明顯的菌落。從各個(gè)樣品分離出來的菌株的菌落形態(tài)學(xué)特征來看，樣品中的耐熱耐酸的脂環(huán)酸芽孢桿菌并不是單一形態(tài)的菌，而是表現(xiàn)為多形態(tài)的產(chǎn)芽孢桿菌。從中挑選出三株有代表性且與標(biāo)準(zhǔn)菌株十分相似的菌株，與標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落形態(tài)觀察結(jié)果見表1，菌落形態(tài)見圖1。由表1可知，分離菌株Ⅰ和分離菌株Ⅱ與標(biāo)準(zhǔn)菌株Ⅱ菌落特征十分相似，乳黃色、圓形、邊緣整齊、表面有褶皺;而分離菌株Ⅲ與標(biāo)準(zhǔn)菌株Ⅰ菌落特征十分相似，乳白色、圓形、邊緣不整齊、表面有少許褶皺，但三株分離菌株的菌落大小均小于標(biāo)準(zhǔn)菌株，只有1～3mm大小。分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的細(xì)菌形態(tài)觀察如表2和圖2所示，由表2和圖2可知標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離株的細(xì)菌形態(tài)十分相似，均為桿狀;革蘭氏染色均為陽性;各菌運(yùn)動(dòng)性的鏡檢法觀察結(jié)果表明，各菌均不運(yùn)動(dòng);芽孢位置均為次端生或端生。

圖1 分離株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落Fig.1 The colony morphology of standard and isolated bacteria

2.2.2 脂環(huán)酸芽孢桿菌生長條件的確定 按1.2.2.3的方法，標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株培養(yǎng)的生長實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知各菌溫度條件在25～60℃范圍內(nèi)、pH在2.4～6.8范圍內(nèi)均能良好生長，從本實(shí)驗(yàn)得到的三株分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌的生長條件基本相同。從它們的生長溫度和p H范圍可以看出，這些菌株不僅可以耐受酸性條件，并且還表現(xiàn)出對(duì)酸性條件的依賴性和嗜好性，均符合脂環(huán)酸芽孢桿菌特有的耐酸耐熱的特性。

2.2.3 脂環(huán)酸芽孢桿菌生理生化反應(yīng)結(jié)果分析 標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株的生理生化反應(yīng)結(jié)果如表4所示。由表4結(jié)果可以看出，除分離菌Ⅲ的淀粉水解為陰性、分離菌Ⅱ和分離菌Ⅲ的N源利用為陰性，這兩個(gè)特征與標(biāo)準(zhǔn)菌株不同外，其余各項(xiàng)生理生化特征與標(biāo)準(zhǔn)菌株相同。由此可見，3株分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株有明顯相似的特征，而出現(xiàn)的差異恰恰可能是由于同屬中不同菌種的差異造成的。

圖2 各菌株顯微鏡形態(tài)觀察結(jié)果(10×100)Fig.2 Micro-morphology of vegetative form(10×100)

表3 各菌株的生長條件分析結(jié)果Table 3 Results of cultural characteristics

表4 各菌株生理生化反應(yīng)分析結(jié)果Table 4 Results of physiological characteristics

2.2.4 各菌株生長曲線結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)菌株Ⅱ與分離菌株Ⅱ在45℃溫度培養(yǎng)下吸光值與培養(yǎng)時(shí)間以及吸光值與各菌細(xì)菌濃度之間的關(guān)系曲線圖如圖3所示。由圖3可見，標(biāo)準(zhǔn)菌株與分離菌株的生長趨勢比較一致，單個(gè)菌落在100m L 1656 BAM-SM液體培養(yǎng)基中在培養(yǎng)24h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，32h進(jìn)入穩(wěn)定生長期，當(dāng)生長到48h后菌體濁度緩慢降低，進(jìn)入衰亡期。標(biāo)準(zhǔn)菌和分離菌在溫度為45℃條件下培養(yǎng)48h后的A600為0.6～0.7時(shí)，活菌數(shù)量可以達(dá)到105～107CFU/m L。

3 討論

圖3 標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株的生長曲線Fig.3 The growth curve of standard and isolated

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室以及分離樣品的實(shí)際情況選擇了BAM培養(yǎng)基，并對(duì)該培養(yǎng)基進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，形成了1656 BAM-SM培養(yǎng)基，同時(shí)采用膜過濾法，該方法取樣量大，而且能夠截留富集果汁中的絕大多數(shù)脂環(huán)酸芽孢桿菌，對(duì)于分離該菌取得了良好的效果。本實(shí)驗(yàn)的蘋果汁樣品以及車間生產(chǎn)用水和設(shè)備清洗用水樣品經(jīng)過熱處理，會(huì)殺滅樣品中某些不能耐受高溫的雜菌，減少了雜菌對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響，同時(shí)在熱處理過程中芽孢可能被激活，給予適當(dāng)溫度的處理會(huì)使芽孢萌發(fā)、繁殖。而分離樣品中的車間生產(chǎn)用水和設(shè)備清洗用水由于pH高于濃縮蘋果汁，使得雜菌數(shù)量和種類也相對(duì)增多，因此經(jīng)過一定的熱處理就更加必要，而且其中所含雜質(zhì)較多，在熱處理前經(jīng)過低速離心以去除水樣中的泥沙等雜質(zhì)將增快膜過濾速度、減少雜菌污染有著重要的意義。

本研究從144個(gè)濃縮蘋果汁和生產(chǎn)用水樣品中，經(jīng)過分離、篩選和純化，首次得到59株分離菌株，將這59株菌株進(jìn)行了耐熱耐酸特性的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其均具有耐熱耐酸的特性，符合脂環(huán)酸芽孢桿菌耐熱耐酸的特點(diǎn)，初步表明和脂環(huán)酸芽孢桿菌同屬于嗜酸耐熱菌;又將其與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行了細(xì)菌形態(tài)、菌落形態(tài)、生長條件以及生理生化反應(yīng)特性的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其與標(biāo)準(zhǔn)菌株具有十分相似的特征，但同時(shí)也存在著一定的差別，故初步判斷這59株分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株同屬于一個(gè)屬，但對(duì)具體種的劃定尚需進(jìn)行進(jìn)一步的研究鑒定。

本研究對(duì)于生長曲線的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了單個(gè)菌落在100m L 1656 BAM-SM液體培養(yǎng)基中在培養(yǎng)24h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，32h進(jìn)入穩(wěn)定生長期，當(dāng)生長到48h后菌體濁度緩慢降低，進(jìn)入衰亡期，這與文獻(xiàn)中有差異［6-7，10］;以及標(biāo)準(zhǔn)菌和分離菌在溫度為45℃條件下培養(yǎng)48h后的A600為0.6～0.7時(shí)，活菌數(shù)量可以達(dá)到 105～107CFU/m L，這與文獻(xiàn)［11］在 47℃ 條件下培養(yǎng)24～48h A600為0.4～0.7時(shí)，活菌數(shù)量可以達(dá)到107～108CFU/m L也存在差異，這可能與選擇的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、該菌的不同地域分布特性是否會(huì)改變其生長特性等因素有關(guān)。對(duì)于生理生化特性的研究，有學(xué)者利用API CHB/E試劑盒進(jìn)行糖醇利用實(shí)驗(yàn)的研究［6，12］，而 Pettipher GL［13］則認(rèn)為 API CHB/E試紙條在37℃和44℃的結(jié)果不一致，不適用于鑒定脂環(huán)酸芽孢桿菌，在本研究中同時(shí)采用傳統(tǒng)方法和APICHB/E試紙條進(jìn)行了生理生化特性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明APICHB/E試紙條適用于溫度在37℃的嗜溫菌，而溫度提高到45℃以上時(shí)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否可信有待進(jìn)一步驗(yàn)證，而且酸化的培養(yǎng)基對(duì)于使用API CHB/E試紙條，其結(jié)果也不明確;同時(shí)API CHB/E試紙條結(jié)果的判定是基于顏色的深淺判斷，這對(duì)于結(jié)果陽性的判斷也帶來難度，帶來不確定性，因此認(rèn)為API CHB/E試紙條不適用于該菌生理生化特性的研究，是否可以用文獻(xiàn)報(bào)道［12］將目標(biāo)碳源(糖、醇)以2g/L直接加入BAM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌種，每隔7d測量pH來判斷其碳源的利用情況的方法有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

脂環(huán)酸芽孢桿菌是一種廣泛分布于世界各地，存在于土壤、溫泉、硫磺礦、有機(jī)物、肥料、熱加工食品、地?zé)岷畬拥乃统猎戎械母锾m氏陽性芽孢桿菌。研究結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)中的144個(gè)濃縮蘋果汁和生產(chǎn)用水樣品，經(jīng)1∶10稀釋、生產(chǎn)用水3∶7稀釋(雜質(zhì)較多時(shí)采用1000r/min低速離心吸取上清)，(80±1)℃熱處理13min，冰水浴中快速冷卻至室溫，0.45μm膜過濾后將濾膜取下貼于1656 BAM-SM固體培養(yǎng)基平板上，45℃培養(yǎng)3～5d得到了59株分離菌株。將其與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其與標(biāo)準(zhǔn)菌株具有相似的培養(yǎng)特性和生理生化特性，可初步判斷為脂環(huán)酸芽孢桿菌，但還需進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，這將為在我國開展該屬新菌種的開發(fā)、鑒定，地域分布特性及源于果汁的新菌株的分離鑒定及其特性研究，對(duì)有效控制其危害提供實(shí)驗(yàn)材料，并且還將為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為生產(chǎn)環(huán)節(jié)中脂環(huán)酸芽孢桿菌的控制提供指導(dǎo)和依據(jù)。

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